Einleitung: Virale Infektionen gefährden global die Gesundheit von Mensch und Tier und stehen unter Beobachtung internationaler Organisationen. Die Eintrittspforte der meisten viralen Erreger sind Schleimhautoberflächen. Das Schleimhaut-assoziierte Immunsystem schützt Lebewesen lokal vor Infektionen. Daher ist das Ziel vieler Impfstoffe eine vor Infektion bzw. Erkrankung schützende Immunantwort zu stimulieren um Schleimhaut-assoziierter Erreger an der Eintrittspforte abzuwehren zu können. Um den Schutz eines Individuums oder einer Population vor solchen viralen Erkrankungen einschätzen zu können, braucht es ein belastbares einfach zu gewinnendes Korrelat. Bei streng Schleimhaut-assoziierten Erregern können Erreger-spezifische Antikörper zwar auch im Serum gefunden werden, doch korreliert die Konzentration in vielen Fällen nicht mit dem Schutz vor Infektion bzw. Erkrankung. Im Menschen wurde ein Zusammenhang zwischen der Konzentration an Antikörpern im Speichel zu denen in der Lungen- bzw. Darmschleimhaut beschrieben.
Ziele der Untersuchungen: Die Untersuchungen in der Arbeit dienten zur Überprüfung der Hypothese, dass die Bestimmung neutralisierender Antikörper im Speichel von Schweinen sich zur Beurteilung des Immunstatus gegenüber streng enteral assoziierten Erregern eignet. Es wurde weiterhin die Hypothese aufgestellt, dass mit Speichelproben der enterale Immunstatus von dem des systemischen differenziert betrachtet werden kann.
Tiere, Material und Methoden: Als Modellpathogen diente das Rotavirus (RV), ein be-deutender Erreger von gastrointestinalen Erkrankungen bei Säuglingen, Kleinkindern und Jungtieren. Zu Beginn der Arbeit wurde ein RV-spezifischer Virusneutralisationstest (VNT) modifiziert und für den Einsatz von Speichel, Serum und Darmschleim validiert. Von 17 individuellen Schweinen wurden die Pathogen-spezifischen neutralisierenden Titer in Serum, Speichel und Darmschleim bestimmt und die erhobenen Titer auf Korrelation zwischen den Probenmaterialien der individuellen Tiere geprüft (Vergleichsstudie). Um die stark variablen Konzentrationen an IgA (Immunglobulin A) und damit auch an neutralisierenden Antikörpern im Speichel auszugleichen, wurde die Normierung anhand von Elektrolyt- und Amylase-konzentrationen im Speichel angestrebt (Normierungsstudie). Der analysierte Datensatz basiert auf den Werten von 34 Speichelproben, die von fünf Schweinen gewonnen wurden. Abschließend wurde überprüft, ob sich die Antikörperbestimmung im Speichel dazu eignet, den Immunstatus post Vakzinierung im Schwein zu beurteilen (Immunisierungsstudie). Erstmalig wurden dafür 18 Sauen eines Bestands über einen Zeitraum von sechs Monaten während der Einführung eines bestandsspezifischen
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RVA-Impfstoffs unter Feldbedingungen begleitet. Für die immunologische Aufarbeitung wurden mittels VNT und IFT (Immunfluoreszenztest) in Speichel- und Blutproben RV-spezifische (neutralisierende) Antikörpertiter bestimmt.
Ergebnisse: Im Rahmen der Arbeit gelang es einen belastbaren RV-spezifischen VNT zu entwickeln. Die Spezifität wurde durch die Anpassung der Viruslast sowie der Proben-Virus- Inokulationszeit im Protokoll gegenüber dem Ursprungsprotokoll verbessert. Die Sensitivität wurde indirekt über den IFT bestimmt und lag in dem Bereich der IFT-Titer von 8.000 bis 40.000. Die Wiederholbarkeit für mittlere bis hohe VNT-Titer entsprach den WAOH-Empfehlungen. Vergleichsstudie: Eine signifikante Korrelation (0,69) konnte zwischen den neutralisierenden Titern im Speichel und den neutralisierenden Titern im Duodenum festgestellt werden. Die Korrelationen zwischen den neutralisierenden Titern im Speichel und denen im Darmschleim waren höher als die Korrelation zwischen den neutralisierenden Titern im Serum und denen im Darmschleim.
Normierungsstudie: Bei der statistischen Auswertung des gesamten Datensatzes ergaben sich keine Hinweise auf Korrelationen zwischen den Amylase- und Elektrolytkonzentrationen und der IgA-Konzentration oder dem VNT-Titer im Speichel. Bei Ausschluss der Datensätze, in denen die IgA-Konzentration im Speichel unter 350 ng/ml lag, zeigte sich jedoch eine signifikant positive Korrelation (Korrelationskoeffizient: 0,7607) der IgA-Konzentration zu den RVC G1P[1]1- spezifischen VNT-Titern (p = 0,0014).
Immunisierungsstudie: Die VNT-Titer im Serum als Korrelat zur systemischen Immunantwort und die Speichel-VNT-Titer als Korrelat zur mukosalen Immunantwort verdeutlichten in der Immunisierungsstudie die differenzierte Immunantwort auf den parenteral verabreichten Totimpfstoff. Die Grundimmunisierung erzeugte sowohl im Serum als auch im Speichel einen signifikanten VNT-Titer-Anstieg. Bei der darauffolgenden Auffrischungsimpfung war lediglich in den Serumproben ein erneuter signifikanter VNT-Titer-Anstieg zu messen. Nach Erreichen des Titer-Höhepunkts fielen die Titer im Speichel innerhalb von zwei Wochen und die im Serum in- nerhalb von drei Monaten auf Werte nahe der Ausgangstiter ab. Mittels der IFT-Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Speichel-VNT-Titer eine stark positive Korrelation zu den IgA- Titern im Blut sowie die Serum-VNT-Titer zu den IgG-Titern im Blut aufweisen. Schlussfolgerungen: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen einen für alle Probenmaterialien geeigneten VNT zu etablieren. Bei Betrachtung aller drei Teilstudien ergeben sich Indizien, die die aufgestellte Hypothese unterstützen. Die Herausforderungen bei der Nutzung von Speichelproben als Diagnostikum konnten auch in dieser Arbeit aufgezeigt werden. Eine Normierung der neutralisierenden Titer im Speichel sollte weiterverfolgt werden. Möglicherweise ist die Gewinnung von Speichel aus den Unterkiefer- bzw. Unterzungendrüsen geeigneter als Diagnostikum. Zusammenfassend betrachtet, zeigen die Untersuchungen dieser Arbeit auf, dass der differenzierten Erhebung der systemischen und der mukosalen Immunantwort eine besondere Bedeutung zukommt und grundlegende Erkenntnisse zum Verständnis immunologischer Reaktionen mittels Speichel-basierter Diagnostik erlangt werden können. / Introduction: Viral infections are a global burden to human and animal health and are in the focus of international organisations. The entry sites of most viral pathogens are mucosal surfaces. The mucosa-associated immune system protects organisms locally against infections. Therefore, the goal of many vaccines is to stimulate a protective immune response against infection or disease in order to combat mucosal-associated pathogens at the site of entry. In order to assess the protection of an individual or a population against such viral diseases, a robust correlate that can be easily obtained is needed. Although pathogen-specific antibodies can be found in serum, the concentration does often not correlate with protection against infection or disease with strictly mucosa-associated pathogens. In humans, a correlation between the concentration of antibodies in saliva and those in the lung or intestinal mucosa has been described.
Objectives: The investigations in this thesis aimed to prove the hypothesis that the determination of neutralising antibodies in the saliva of pigs is suitable for the assessment of the immune status against enteral associated pathogens. It was further hypothesised that saliva samples can be used to differentiate the mucosal immune status from the systemic immune status.
Animals, material and methods: Rotavirus (RV), a significant pathogen of gastrointestinal diseases in infants, children and young animals, served as a model. At the beginning of the work, an RV-specific virus neutralisation Assay (VNA) was modified and validated for use with saliva, serum and intestinal mucus. Pathogen-specific neutralising titres were determined in serum, saliva and intestinal mucus from 17 individual pigs and the titres obtained were tested for correlation between the sample materials of the individual animals (comparative study). In order to compensate for the highly variable concentrations of IgA (immunoglobulin A) and thus also of neutralising antibodies in saliva, normalisation was aimed at using electrolyte and amylase concentrations in saliva (normalisation study). The analysed data set is based on the values of 34 saliva samples obtained from five pigs. Finally, it was examined whether the determination of antibodies in saliva is suitable for assessing the post-vaccination immune status in pigs (immunisation study). For the first time, 18 sows of a herd were followed over a period of six months during the introduction of a herd-specific RVA vaccine under field conditions. For immunological work-up, RV specific (neutralising) antibody titres were determined by VNA and IFA (immune fluorescence assay) in saliva and blood samples.
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Results: In the work developing of a robust RV-specific VNA was successful. The specificity was improved by adjusting the viral load as well as the sample-virus inoculation time in the protocol compared to the original protocol. Sensitivity was determined indirectly by IFA and was in the range of IFA titres from 8,000 to 40,000. Repeatability for intermediate to high VNA titres was in line with WAOH recommendations.
Comparative study: A significant correlation (0.69) was found between the neutralising titres in saliva and the neutralising titres in the duodenum. The correlations between the neutralising titres in saliva and those in intestinal mucus were higher than the correlation between the neutralising titres in serum and those in intestinal mucus. Normalisation study: Statistical analysis of the entire data set revealed no evidence of correlations between the amylase and electrolyte concentrations and the IgA concentration or the VNA titre in saliva. However, when excluding the datasets in which the salivary IgA concentration was below 350 ng/ml, there was a significant positive correlation (correlation coefficient: 0.7607) of IgA concentration to RVC G1P[1]1-specific VNA titres (p = 0.0014).
Immunisation study: The serum VNA titres as a correlate of the systemic immune response and the saliva VNA titres as a correlate of the mucosal immune response illustrated the differential immune response to the parenterally administered inactivated vaccine in the immunisation study. The primary immunisation produced a significant VNA titer increase in both serum and saliva. During the subsequent booster vaccination, a renewed significant VNA titer increase was only measured in the serum samples. After reaching the titer peak, the titres in saliva dropped to values close to the initial titres within two weeks and those in serum within three months. By means of the IFA examinations, it could be shown that the salivary VNA titres showed a strong positive correlation to the IgA titres in the blood and the serum VNA titres to the IgG titres in the blood. Conclusion: Within the framework of the present work, it was possible to establish a VNA suitable for all sample materials. Considering all three sub-studies, there are indications that support the hypothesis that was established. The challenges in the use of saliva samples as a diagnostic tool could also be demonstrated in this work. A standardisation of the neutralising titres in saliva should be further pursued. It may be that the collection of saliva from the submandibular or sublingual glands is more appropriate as a diagnostic tool. In summary, the investigations of this study show that the differentiated assessment of the systemic and mucosal immune response is of particular importance and that fundamental insights into the understanding of immunological reactions can be gained by means of saliva-based diagnostics.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:91527 |
| Date | 17 May 2024 |
| Creators | Harzer, Maxi |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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