Made available in DSpace on 2014-08-20T13:33:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1
tese_marcelo_mendonca.PDF: 4204978 bytes, checksum: e41a9490cdb350a5e7add8e129afdd82 (MD5)
Previous issue date: 2011-12-01 / The conventional methods used to detect the Listeria monocytogenes in foods are
laborious and expensive, requiring several days for final identification. Monoclonal
antibody (MAb) based immunoassays are highly specific and rapid to perform,
especially when MAbs are raised to conserved virulence factors in the pathogen.
Among diverse virulence factors of L. monocytogenes, the surface protein internalin
A (InlA) is one of the most well-known and characterized protein, being an excellent
target as it is highly exposed on the surface and exclusive of pathogenic species. In
this work we report the production, characterization and use of a panel of MAbs
against InlA (2D12, 3B7, 4E4), and a MAb (3F8) which specifically recognizes all
bacteria belonging the genus Listeria. MAbs were produced by the immunization of
BALB/c mice with a recombinant InlA together with heat killed L. monocytogenes.
The MAbs produced showed excellent reativities by indirect ELISA, Western blot and
immunofluorescence. A Cy5 conjugated anti-InlA MAb-2D12 was used as detection
antibody for L. monocytogenes in a sandwich-like fiber optic immunoassay. Using
MAb-2D12 as capture antibody on the waveguides, the limit of detection was ~3 x
102 CFU.mL-1, and when MAb-3F8 was used for capture the limit of detection was ~1
x 105 CFU.mL-1. Furthermore, MAbs 2D12 and 3F8 were used to coat paramagnetic
beads and tested in the immunomagnetic separation (IMS) of L. monocytogenes from
pure cultures, and artificially contaminated cheeses and hotdogs. After IMS capture,
bacteria were released from the beads, used in the fiber optic assay or plated on
agar for counting. In parallel, the capture of L. monocytogenes was confirmed by
real-time qPCR and light-scattering technology (BARDOT). Using IMS to concentrate
and separate L. monocytogenes, followed by a fiber optic platform, it was possible to
detect in less than 22 h, approximately 40 CFU/g of L. monocytogenesi, even in the
presence of L. innocua in cheese and hot dogs artificially contaminated. In addition,
using mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) the protein to which MAb-3F8 binds, was
identified as fructose 1,6-bisphosphate aldolase (FBA). The results presented in this
work indicate that using both systems together, the IMS and fiber optic
immunosensor, were more reliable and faster, and could be applied in the routinely
for detection of L. monocytogenes in food. Moreover, both MAbs have the potential to
useful in others biosensor platforms, as well as in other detection and functionality
immunoassays for InlA and FBA in Listeria. / Os métodos convencionais empregados para detecção de Listeria monocytogenes
em alimentos são laboriosos e onerosos, requerendo vários dias para sua
identificação final. A utilização de anticorpos monoclonais (MAbs) em imunoensaios
para detecção rápida de bactérias tem como vantagem a alta especificidade e
rapidez, principalmente quando direcionados para fatores de virulência conservados.
Dentre os diversos fatores de virulência de Listeria, a proteína de membrana
internalina A (InlA), é umas das mais bem caracterizadas, sendo um excelente alvo
por ser altamente exposta na superfície e exclusiva de espécies patogênicas. Neste
trabalho é relatado a produção, caracterização e utilização em métodos de
diagnósticos de um painel de MAbs contra a InlA (2D12, 3B7, 4E4), e de um MAb
(3F8) que reconhece especificamente todas as bactérias do gênero Listeria. Na
produção dos MAbs, camundongos BALB/c foram imunizados com uma proteína
recombinante InlA (rInlA) concomitantemente com L. monocytogenes inativadas por
fervura. Os MAbs gerados demonstraram excelente reatividade por ELISA indireto,
Western blot e imunofluorescência. O MAb anti-InlA 2D12 marcado com Cy5 foi
usado como anticorpo de detecção de L. monocytogenes, no sistema tipo sanduíche
de sensor de fibra óptica. Usando MAb-2D12 como anticorpo de captura nas fibras
ópticas, obteve-se um limite de detecção de ~3 x 102 CFU.mL-1, e um limite de
detecção de ~1 x 105 CFU.mL-1 foi visualizado com MAb-3F8 como captura. Os
MAbs anti-InlA 2D12 e anti-Listeria 3F8 foram posteriormente utilizados para
sensibilizar esferas paramagnéticas e testados na separação imunomagnética (IMS)
de L. monocytogenes em culturas puras, e em queijo e salsichas tipo hotdog
artificialmente contaminados. Após a captura por IMS, as bactérias foram liberadas,
incubadas com a fibra óptica ou plaqueadas em agares para contagem. Em paralelo,
a confirmação da captura de L. monocytogenes foi realizada por PCR quantitativo
em tempo real e por light-scattering technology (BARDOT). Utilizando IMS para
separar e concentrar L. monocytogenes, seguido da utilização em plataforma de
fibra óptica, foi possível realizar a detecção em menos de 22 horas, de
aproximadamente 40 UFC/g de L. monocytogenes em presença de L. innocua, em
queijo e salsicha artificialmente contaminados. Além disso, a proteína alvo do MAb3F8
foi identificado como frutose 1,6-bifosfato aldolase através de espectrometria de
massa (MALDI-TOF-MS). Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que a
utilização em conjunto dos sistemas de IMS e fibra óptica com os MAb-2D12 e MAb3F8,
foram confiáveis e rápidos, e assim, podendo ser empregados em
imunoensaios de rotina para detecção de L. monocytogenes em alimentos. Contudo,
ambos MAbs possuem ainda grande potencial para serem mais explorados em
outras plataformas de biossensores, assim como, em outros imunoensaios de
detecção e funcionalidade de InlA e FBA em Listeria
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpel.edu.br:123456789/1299 |
| Date | 01 December 2011 |
| Creators | Mendonça, Marcelo |
| Contributors | CPF:15711986600, http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783342J3&dataRevisao=null, Aleixo, José Antonio Guimarães |
| Publisher | Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFPel, BR, Biotecnologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPEL, instname:Universidade Federal de Pelotas, instacron:UFPEL |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0027 seconds