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Avaliação de técnicas de diagnóstico de Cryptosporidium spp. e Giardia lamblia em fezes humanasSouza, Doris Sobral Marques January 2002 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T09:27:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A diarréia é responsável por mais de 3 milhões de mortes ao ano no mundo e a maioria dos casos ocorre em crianças de países em desenvolvimento. A diarréia em crianças, além dos problemas relacionados à desidratação, ainda pode ocasionar má absorção dos nutrientes causando um quadro de desnutrição afetando, até mesmo, as funções cognitivas. Muitos patógenos causadores de diarréia podem ser veiculados pela água e por alimentos contaminados. Eles podem ser vírus, bactérias e parasitas. Os protozoários Cryptosporidium spp. e Giardia lamblia são importantes causadores de diarréia, principalmente em crianças. Estima-se que no Brasil a prevalência destes patógenos seja de 8% e 28,5%, respectivamente. Devido a cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium serem estruturas muito pequenas, sua detecção torna-se difícil, já que as fezes naturalmente possuem muitos detritos e microrganismos que podem mascarar ou ser confundidos com estes protozoários. Para facilitar e tornar mais eficiente este diagnóstico, este trabalho teve por objetivo padronizar a Técnica de Imunoseparação Magnética (IMS) acoplada à Imunofluorescência (IFA) para o diagnóstico de Cryptosporidium spp. e Giardia lamblia em fezes humanas, além de avaliar sua eficiência quando comparada às Técnicas Clássicas descritas por Faust et al. (1939) e por Lutz (1919), ou Hoffman Pons & Janner (1934), quando utilizadas para o diagnóstico da giardíase; e por fim avaliar as prevalências de Cryptosporidium spp. e Giardia lamblia em uma creche e em ambulatórios de dois Hospitais da Grande Florianópolis-SC. Os resultados da Padronização da Técnica, utilizando-se 4 tratamentos com 3 repetições para cada, demonstraram que a IMS-IFA foi capaz de recuperar oocistos de Cryptosporidium spp. (média de 4,7%) e cistos de Giardia lamblia (média de 1,3%) em fezes humanas. Quando comparadas, as recuperações das duas espécies, não apresentaram diferenças significativas (F > 0,05). Ao se comparar o desempenho das Técnicas de IMS-IFA com a de Faust et al. e a de Lutz no diagnóstico de G. lamblia, utilizando-se 127 amostras de fezes de crianças, percebeu-se que a primeira deteve vantagem quando comparada às outras duas técnicas em conjunto, mas quando se comparou a recuperação de cistos pela primeira em relação à soma dos resultados da segunda (confirmados ou não pela Técnica de Lutz) observou-se que as diferenças não foram significativas (?2< 0,05). Avaliando-se as prevalências de Cryptosporidium spp. e Giardia lamblia encontradas em 77 crianças de uma creche e de 50 crianças de ambulatório, ambos na Grande Florianópolis, observou-se que para Cryptosporidium spp. estas foram baixas e próximas nas duas populações (1,3% e 2% respectivamente). Para Giardia lamblia, elas se comportaram de forma bastante distinta (45,5% e 2% respectivamente) e estatisticamente significativa. Também se detectou diferenças quando foram comparadas crianças menores com as maiores de 5 anos de idade dentro da mesma população (creche ou ambulatório) e na prevalência de giardíase comparando-se as faixas etárias analisadas das duas populações. A IMS-IFA mostrou-se capaz de detectar cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium em fezes humanas e, devido a sua especificidade, não se fez necessária a confirmação através de outras metodologias de diagnóstico para Cryptosporidium.
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Anticorpos Monoclonais contra Listeria spp.: Produção, Caracterização e Aplicação em Métodos Diagnósticos / Monoclonal Antibodies againstListeria spp.: Production, Characterization and Application in Diagnostic MethodsMendonça, Marcelo 01 December 2011 (has links)
Made available in DSpace on 2014-08-20T13:33:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2011-12-01 / The conventional methods used to detect the Listeria monocytogenes in foods are
laborious and expensive, requiring several days for final identification. Monoclonal
antibody (MAb) based immunoassays are highly specific and rapid to perform,
especially when MAbs are raised to conserved virulence factors in the pathogen.
Among diverse virulence factors of L. monocytogenes, the surface protein internalin
A (InlA) is one of the most well-known and characterized protein, being an excellent
target as it is highly exposed on the surface and exclusive of pathogenic species. In
this work we report the production, characterization and use of a panel of MAbs
against InlA (2D12, 3B7, 4E4), and a MAb (3F8) which specifically recognizes all
bacteria belonging the genus Listeria. MAbs were produced by the immunization of
BALB/c mice with a recombinant InlA together with heat killed L. monocytogenes.
The MAbs produced showed excellent reativities by indirect ELISA, Western blot and
immunofluorescence. A Cy5 conjugated anti-InlA MAb-2D12 was used as detection
antibody for L. monocytogenes in a sandwich-like fiber optic immunoassay. Using
MAb-2D12 as capture antibody on the waveguides, the limit of detection was ~3 x
102 CFU.mL-1, and when MAb-3F8 was used for capture the limit of detection was ~1
x 105 CFU.mL-1. Furthermore, MAbs 2D12 and 3F8 were used to coat paramagnetic
beads and tested in the immunomagnetic separation (IMS) of L. monocytogenes from
pure cultures, and artificially contaminated cheeses and hotdogs. After IMS capture,
bacteria were released from the beads, used in the fiber optic assay or plated on
agar for counting. In parallel, the capture of L. monocytogenes was confirmed by
real-time qPCR and light-scattering technology (BARDOT). Using IMS to concentrate
and separate L. monocytogenes, followed by a fiber optic platform, it was possible to
detect in less than 22 h, approximately 40 CFU/g of L. monocytogenesi, even in the
presence of L. innocua in cheese and hot dogs artificially contaminated. In addition,
using mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) the protein to which MAb-3F8 binds, was
identified as fructose 1,6-bisphosphate aldolase (FBA). The results presented in this
work indicate that using both systems together, the IMS and fiber optic
immunosensor, were more reliable and faster, and could be applied in the routinely
for detection of L. monocytogenes in food. Moreover, both MAbs have the potential to
useful in others biosensor platforms, as well as in other detection and functionality
immunoassays for InlA and FBA in Listeria. / Os métodos convencionais empregados para detecção de Listeria monocytogenes
em alimentos são laboriosos e onerosos, requerendo vários dias para sua
identificação final. A utilização de anticorpos monoclonais (MAbs) em imunoensaios
para detecção rápida de bactérias tem como vantagem a alta especificidade e
rapidez, principalmente quando direcionados para fatores de virulência conservados.
Dentre os diversos fatores de virulência de Listeria, a proteína de membrana
internalina A (InlA), é umas das mais bem caracterizadas, sendo um excelente alvo
por ser altamente exposta na superfície e exclusiva de espécies patogênicas. Neste
trabalho é relatado a produção, caracterização e utilização em métodos de
diagnósticos de um painel de MAbs contra a InlA (2D12, 3B7, 4E4), e de um MAb
(3F8) que reconhece especificamente todas as bactérias do gênero Listeria. Na
produção dos MAbs, camundongos BALB/c foram imunizados com uma proteína
recombinante InlA (rInlA) concomitantemente com L. monocytogenes inativadas por
fervura. Os MAbs gerados demonstraram excelente reatividade por ELISA indireto,
Western blot e imunofluorescência. O MAb anti-InlA 2D12 marcado com Cy5 foi
usado como anticorpo de detecção de L. monocytogenes, no sistema tipo sanduíche
de sensor de fibra óptica. Usando MAb-2D12 como anticorpo de captura nas fibras
ópticas, obteve-se um limite de detecção de ~3 x 102 CFU.mL-1, e um limite de
detecção de ~1 x 105 CFU.mL-1 foi visualizado com MAb-3F8 como captura. Os
MAbs anti-InlA 2D12 e anti-Listeria 3F8 foram posteriormente utilizados para
sensibilizar esferas paramagnéticas e testados na separação imunomagnética (IMS)
de L. monocytogenes em culturas puras, e em queijo e salsichas tipo hotdog
artificialmente contaminados. Após a captura por IMS, as bactérias foram liberadas,
incubadas com a fibra óptica ou plaqueadas em agares para contagem. Em paralelo,
a confirmação da captura de L. monocytogenes foi realizada por PCR quantitativo
em tempo real e por light-scattering technology (BARDOT). Utilizando IMS para
separar e concentrar L. monocytogenes, seguido da utilização em plataforma de
fibra óptica, foi possível realizar a detecção em menos de 22 horas, de
aproximadamente 40 UFC/g de L. monocytogenes em presença de L. innocua, em
queijo e salsicha artificialmente contaminados. Além disso, a proteína alvo do MAb3F8
foi identificado como frutose 1,6-bifosfato aldolase através de espectrometria de
massa (MALDI-TOF-MS). Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que a
utilização em conjunto dos sistemas de IMS e fibra óptica com os MAb-2D12 e MAb3F8,
foram confiáveis e rápidos, e assim, podendo ser empregados em
imunoensaios de rotina para detecção de L. monocytogenes em alimentos. Contudo,
ambos MAbs possuem ainda grande potencial para serem mais explorados em
outras plataformas de biossensores, assim como, em outros imunoensaios de
detecção e funcionalidade de InlA e FBA em Listeria
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