O estudo de processos de tradução do código genético em proteínas desperta o interesse pelo seu papel central no metabolismo celular, em particular, o estudo da via de síntese de novos aminoácidos, como a selenocisteína e a pirrolisina, que resultam na expansão do código genético dos 20 aminoácidos canônicos para um total de 22 aminoácidos. A selenocisteína (Sec, U) é um aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação ocorre através de um processo cotraducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase, usualmente interpretado como códon de parada. Essa incorporação requer uma complexa maquinaria molecular distinta entre os três domínios da vida em que as selenoproteínas estão presentes: Bactéria, Arquéia e Eucária. Em Escherichia coli, a via se inicia com a aminoacilação do tRNA específico para a incorporação de selenocisteínas (SelC, tRNASec) com um resíduo de L-serina pela seril-tRNA sintetase (SerRS) formando o tRNA carregado Ser-tRNA[Ser]Sec que é entregue ao complexo homodecamérico selenocisteína sintase (SelA) responsável pela conversão Ser-Sec utilizando a forma biológica de selênio entregue pela enzima selenofosfato sintetase (SelD). Uma vez carregado com L-selenocisteína, o Sec-tRNASec é então carreado pelo fator de elongação específico para selenocisteínas (SelB) para a sua incorporação na cadeia polipeptídica nascente na posição UGA adjunta ao elemento SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence), uma estrutura em grampo presente no RNA mensageiro que indica o códon de inserção de selenocisteínas. Uma vez que elementos contendo selênio são tóxicos para o ambiente celular, interações entre as enzimas da via se fazem necessárias, onde as enzimas participantes em procariotos são conhecidas e caracterizadas individualmente, no entanto, suas interações macromoleculares nas diferentes etapas ainda não foram caracterizadas. Este projeto visa à caracterização macromolecular e estrutural das interações entre as enzimas SelA e SelB com os RNAs participantes tRNASec e SECIS além do ribossomo de E. coli. Para isso, amostras de SelA, SelB, tRNASec, SECIS e ribossomo foram obtidas através de diferentes metodologias. Para SelA e tRNASec foram utilizados protocolos já estabelecidos enquanto que, para SelB, fez-se necessário a otimização do protocolo previamente publicado e, consequentemente, nova caracterização biofísica através de metodologias como dicroísmo dircular (CD) e fluorescência intrínseca (IFS). Para análise das interações, medidas de espectroscopia de anisotropia de fluorescência (FAS), ultracentrifugação analítica (AUC) e calorimetria de varredura diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação dos parâmetros de interação dos diferentes complexos estudados. Somado a isso, experimentos de cinética GTPásica foram realizados na formação dos complexos e, além disso, foram gerados modelos estruturais utilizando diferentes metodologias como espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) além de estudos por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação deste aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de elucidar o mecanismo sequencial de eventos, provendo conhecimento e desenvolvendo metodologias para sistemas complexos de interação proteína-proteína e proteína-RNA. / The study of genetic code processes in proteins is a central role in cell metabolism, in particular the study of the synthesis pathway of new amino acids, such as selenocysteine and pyrrolisine, which resulted in the expansion of the genetic code of the 20 canonical amino acids for 22 amino acids. Selenocysteine (Sec, U) is an amino acid that represents a major biological form of selenium element and its incorporation through a co-translational process in selenoproteins in response to the in-phase UGA-codon, usually interpreted as stop-codon. This incorporation requires a complex molecular machinery distinct between the three domains of life in which, as selenoprotein has present: Bacteria, Archaea and Eukaria. In Escherichia coli, an initiation pathway with an aminoacylation of the tRNA specific for the incorporation of selenocysteines (SelC, tRNASec) with an L-serine residue by seril-tRNA synthetase (SerRS) resulting in the charged tRNA Ser-tRNA[Ser] Sec that is delivered to the homodecameric complex selenocysteine synthase (SelA), responsible for Ser-Sec conversion using the biological form of selenium delivered by the enzyme selenophosphate synthetase (SelD). Once loaded with L-selenocysteine, Sec-tRNASec is then carried by the selenocysteine-specific elongation factor (SelB) for incorporation into the nascent polypeptide chain at the UGA position attached to the SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence) element, staple structure that indicates the insertion codon of selenocysteines. Since elements containing selenium are toxic to the cell, interactions between how pathway enzymes are made, where the enzymes participating in concepts are known and characterized individually, however, their macromolecular interactions in the different steps have not yet been characterized. This project aims at the macromolecular and structural characterization of the interactions between SelA and SelB enzymes with the RNAS tRNASec and SECIS participants in addition to the E. coli ribosome. For this, as samples of SelA, SelB, tRNASec, SECIS and ribosome were obtained through different methodologies. For SelA and tRNASec, protocols were used to determine parameters for SelB, it was necessary to optimize a previously published protocol and, consequently, a new biophysical characterization through methodologies such as circular dichroism (CD) and intrinsic fluorescence spectroscopy (IFS). To analyze the interactions, measurements of fluorescence anisotropy spectroscopy (FAS), analytical ultracentrifugation (AUC) and differential scanning calorimetry (DSC) were used to determine the interaction parameters of different complexes studied. In addition, GTPases activity experiments were carried out in the formation of the complexesand, in addition, we have generated models that characterize different methodologies such as small angles X-ray scattering (SAXS) and transmission electron microscopy (TEM). The proposed studies will aid in understanding the mechanism of incorporation of this amino acid into bacteria as well as the other domains of life besides elucidating the sequential mechanism of events, providing knowledge and development of methodologies for complex protein-protein and RNA-protein interaction systems.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-10052017-081231 |
| Date | 03 March 2017 |
| Creators | Serrão, Vitor Hugo Balasco |
| Contributors | Portugal, Rodrigo Villares, Thiemann, Otavio Henrique |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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