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Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A maioria dos cães com leishmaniose visceral submetida à quimioterapia convencional apresenta recaída após a interrupção do tratamento, talvez, pelo fato desses animais desenvolverem resposta imune celular específica apenas transitoriamente. Uma vez que as citocinas IL-7 e IL-15 são descritas na literatura como sendo capazes de promover resposta imune celular de longa duração (memória), o presente trabalho teve como objetivo a clonagem, a expressão e a avaliação da atividade biológica de IL7 e IL-15 recombinantes caninas (rca-IL-7 e rcaIL-15). Diversos estudos têm demonstrado o papel essencial da IL-7 e IL-15 na homeostase de células-T. A Interleucina-7 é um fator de crescimento e anti-apoptótico de linfócitos T, sendo essencial para a sobrevida de células T maduras, naïve e células de memória, especialmente CD4+. IL-15 apresenta um amplo espectro de atividades biológicas. É crucial para o desenvolvimento, proliferação, sobrevivência e diferenciação de múltiplas células tanto da imunidade inata, quanto da imunidade adaptativa, e apresenta papel essencial na manutenção de células T CD8+ de memória. Nesse trabalho descreveu-se a clonagem do DNA complementar (cDNA) e a expressão de IL-7 e IL-15 recombinantes caninas biologicamente ativas em Escherichia coli. Para expressão em E. coli foram realizadas as clonagens do cDNA de IL-7 e de IL-15 no vetor pRSET, gerando as construções pRSET-caIL-7 e pRSET-caIL-15. O sucesso da clonagem em ambos os vetores de expressão foi confirmado a partir do sequenciamento. As proteínas foram expressas como proteína de fusão com seis moléculas de histidina na extremidade amina da cadeia polipeptídica e após serem solubilizadas com uréia, as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade e renaturadas por diálise. A avaliação da atividade biológica de IL-15 canina purificada foi realizada em células CTLL-2 e foi demonstrada uma relação dose dependente na faixa de concentração proteica de 0,9 ng/mL até 1 µg/mL. O mesmo efeito foi demonstrado quando essas células foram cultivadas na presença de diferentes diluições de T-STIM (controle positivo do ensaio). Visando determinar as condições em que rca-IL-7 e rca-IL-15 são capazes de induzir efeitos biológicos in vitro, foram realizados experimentos com diferentes doses de ambas as citocinas e demonstrado pela primeira vez que tanto IL-7 quanto IL-15 são capazes de induzir a proliferação de CMNSP de cães pré-ativadas com PHA. Adicionalmente, as citocinas foram avaliadas quanto à capacidade de estimulação da proliferação de CMNSP de cães sem estímulo prévio ou concomitante e foi possível observar que rca-IL-7 foi capaz de manter a proliferação dessas células por até 12 dias de cultivo, enquanto rca-IL-15 foi capaz de fazê-lo por até 14 dias. Diante dos resultados obtidos a rca-IL-7 e rca-IL-15 poderão ser utilizadas no futuro em estudos que visam o estabelecimento de uma resposta de longa duração em cães com LVC submetidos à quimioterapia convencional. / Most dogs with LV subjected to conventional chemotherapy has relapsed after
discontinuation of treatment, possibly due these animals develop specific cellular
immune response transiently. Since IL-7 and IL-15 are described in the literature
asbeing capable of promoting cellular immune response of long-term (memory), this
study aimed at cloning, expression and biological activity evaluation of rca-IL7 and rca
IL-15. Many studies have demonstrated the essential role of IL-7 and IL- 15 in the
homeostasis of T-cells. The Interleukin-7 is a growth and anti-apoptotic factor of T
lymphocytes, essential for the occurrence of mature, naive, and memory T cells,
especially CD4+. IL-15 presents a wide spectrum of biological activities. It is crucial for
the development, proliferation, survival, and differentiation of multiple cells of innate
immunity as well as of adaptive immunity, and presents an essential role in the
maintenance of CD8+ memory T cells. This work describes the cloning of
complementary DNA (cDNA) and the expression of IL-7 and IL-15 canine recombinants
biologically active in Escherichia coli. For expression in E. coli, we cloned cDNA of IL-7
and IL- 15 in the vector pRSET, generating the constructions pRSET-caIL7 and pRSETcaIL-
15. The success of the cloning in both the expression vectors was confirmed from
the sequencing. The proteins were expressed as fusion protein with six molecules of
histidine in the amine extremity of the polypeptide chain and afterwards were solubilized
with urea, the proteins were purified by affinity chromatography and renatured by
dialysis. The evaluation of the biological activity of purified canine IL-15 was achieved in
CTLL-2 cells and a dose-dependent relation in the range of protein concentration of 0.9
ng/mL to 1 ƒÊg/mL was demonstrated. The same effect was demonstrated when these
cells were cultivated in the presence of different dilutions of T-STIM (positive control of
the test). With the goal of determining the conditions in which rca-IL-7 and rca-IL-15 are
capable of inducing biological effects in vitro, we carried out experiments with different
doses with both the cytokines and demonstrated for the first time that IL-7 as well as IL-
15 are capable of inducing proliferation of PBMC of dogs pre-activated with PHA. Also,
the cytokines were evaluated as to the capacity of stimulation of the proliferation of
PBMC of dogs without previous or concomitant stimulation and it was possible to
observe that rca-IL-7 was capable of maintaining the proliferation of these cells for up to
12 days of cultivation, while rca-IL-15 was capable of doing it for 14 days. Considering
the results obtained rca-rca-7 and IL-IL-15 may be used in future studies that aim to
establish a long-termresponse in dogs with CVL undergoing conventional chemotherapy
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/7152 |
| Date | January 2011 |
| Creators | Paiva, Bianca Petitinga |
| Contributors | Atta, Ajax Mercês, Bessa, Theolis Costa Barbosa, Oliveira, Geraldo Gileno de Sá |
| Publisher | Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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