Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-05-11T16:05:45Z No. of bitstreams: 1 Barbara Maria Nascimento de Oliveira Produção... 2016.pdf: 2363764 bytes, checksum: ec48ade14eccf109aecb436eec7cd66a (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-05-11T16:05:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Barbara Maria Nascimento de Oliveira Produção... 2016.pdf: 2363764 bytes, checksum: ec48ade14eccf109aecb436eec7cd66a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-11T16:05:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbara Maria Nascimento de Oliveira Produção... 2016.pdf: 2363764 bytes, checksum: ec48ade14eccf109aecb436eec7cd66a (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / INTRODUÇÃO. A interleucina 7 (IL-7) é uma citocina pleiotrópica produzida principalmente por células estromais da medula óssea, células epiteliais tímicas e intestinais. IL-7 e que promove o desenvolvimento de linfócitos T e B e diferenciação de células T memória, especialmente CD4+. Por isso, diversos autores têm estudado a capacidade de IL-7 promover a restauração da população de linfócitos em situações de linfopenia e resposta imune de memória. Cães que desenvolvem leishmaniose visceral e recebem tratamento especfico apresentam cura clínica. No entanto, após a interrupção do tratamento, a maioria dos animais exibe recaída da doença, mesmo na ausência de reinfecção. É possível que esse fenômeno esteja associado a uma dificuldade de estabelecimento de linfócitos T de memória específicos para Leishmania em cães. Em nosso laboratório, tentativas prévias foram realizadas para produzir a IL-7 canina em Escherichia coli, no entanto, o rendimento da proteína biologicamente ativa foi pequeno. OBJETIVO. Por isso, resolveu-se avaliar a viabilidade de produzir IL-7 do sistema baculovírus-células de inseto. MATERIAL E MÉTODOS. No presente trabalho, uma construção de DNA foi concebida contendo uma sequência de nucleotídeos que codificam o peptídeo sinal da proteína GP64 do baculovírus da Autographa californica (AcMNPV), a IL-7 canina (proteína madura) com códons otimizados para a tradução em Trichoplusia ni, um espaçador com 23 aminoácidos e uma cauda de seis histidinas. A construção de DNA elaborada foi sintetizada quimicamente, inserida em um plasmídeo de clonagem (pUC57-GP64caIL-7), subclonada em um plasmídeo carreador (pFastBac1- GP64caIL-7), adequado para o sistema baculovirus-célula de inseto, e transferida para o cromossoma artificial do baculovírus recombinante (bacmídeo). RESULTADOS. A produção de IL-7 recombinante canina (rcaIL-7) em células de inseto infectadas com baculovírus recombinante foi otimizada. Em seguida, a rcaIL-7 foi produzida em células High-five cultivadas em suspensão utilizando multiplicidade de infecção (MOI) de 5 e tempo de infecção (TOI) de 48 h. A proteína recombinantes foi purificada por cromatografia de afinidade em Sepharose-níquel, obtendo-se um rendimento médio de 5,5 mg por litro de cultivo. CONCLUSÃO. RcaIL-7 purificada, avaliada a 40 ng/mL, mostrou-se capaz de promover a proliferação de células mononucleares de sangue periférico de cães sadios, sem estímulo prévio ou concomitante, indicando que a proteína foi produzida biologicamente ativa. Futuros estudos serão realizados para avaliar a capacidade imunomoduladora da rcaIL-7 em cães e determinar a utilidade dessa citocinas no tratamento de enfermidades caninas, como por exemplo, na leishmaniose visceral canina. / INTRODUCTION. The interleukin 7 is a pleiotropic cytokine produced mainly by bone marrow stromal cells, thymus and intestinal epithelial cells. IL-7 promotes the development of T and B limphocytes and differentiation T cells to memory cells, especially T CD4+ cells. For these reasons, several authors have studied the ability of IL- 7 to promote restoration of the lymphocyte population in cases of lymphopenia and memory imune responses. Dogs which develop visceral leishmaniasis and are treated with specific drugs develop only transient clinical cure. After treatment withdrawal, most animals show disease relapse, even in the absence of reinfection. One possible explanation for the lack of control of the infection after treatment in dogs is a difficulty to develop/maintain specific memory T cells. Therefore, it is possible that effective treatments for canine visceral leishmaniasis be developed by manipulating the immune system. Previously, in our laboratory, it was attemped to produce recombinant canine IL- 7 (rcaIL-7) in Escherichia coli, however there was a low yield of biologically active protein. OBJECTIVE. In the current project, the baculovírus-insect cell system was evaluated to produce rcaIL-7. MATERIAL AND METHODS. In this study, a construction of DNA was designed to encode nucleotides of Autographa californica GP64 signal peptide, canine IL-7 (mature protein) with optimized codons for Trichoplusia ni, a 23-amino acid spacer and a six histidine tail. The DNA construct was chemically synthesized, inserted into a cloning plasmid (pUC57-GP64caIL-7), subcloned into a carrier plasmid (pFastBac1-GP64caIL-7), suited to the baculovirus-insect cell expression system, and transfered to an artificial chromosome of the recombinant baculovirus (bacmid). RESULTS. Recombinant protein expression was optimizatized, then, the rcaIL-7 was produced in a cell culture in suspension using multiplicity of infection (MOI) 5 and time of infection (TOI) 48 hours. Subsequently rcaIL-7 was purified by Nickel Sepharose-Affinity chromatography, obtaining an average yield of 5.5 mg per liter of culture. CONCLUSION. The purified recombinant rcaIL-7 at 40 ng/mL was able to induce prolifereation of peripheral blood mononuclear cells of heath adult dog, suggesting it was biologically active. Given the results, the rcaIL-7 may be used in further studies to assess its ability to modulate canine immune system, that would be useful for the development immunotherapy

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Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-15T16:35:40Z No. of bitstreams: 1 Bianca_Petitinga_de_Paiva. Produção e avaliação...2011.pdf: 1434436 bytes, checksum: f5c3b8722c06f5784b6ec44bc9937084 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-15T16:35:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bianca_Petitinga_de_Paiva. Produção e avaliação...2011.pdf: 1434436 bytes, checksum: f5c3b8722c06f5784b6ec44bc9937084 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A maioria dos cães com leishmaniose visceral submetida à quimioterapia convencional apresenta recaída após a interrupção do tratamento, talvez, pelo fato desses animais desenvolverem resposta imune celular específica apenas transitoriamente. Uma vez que as citocinas IL-7 e IL-15 são descritas na literatura como sendo capazes de promover resposta imune celular de longa duração (memória), o presente trabalho teve como objetivo a clonagem, a expressão e a avaliação da atividade biológica de IL7 e IL-15 recombinantes caninas (rca-IL-7 e rcaIL-15). Diversos estudos têm demonstrado o papel essencial da IL-7 e IL-15 na homeostase de células-T. A Interleucina-7 é um fator de crescimento e anti-apoptótico de linfócitos T, sendo essencial para a sobrevida de células T maduras, naïve e células de memória, especialmente CD4+. IL-15 apresenta um amplo espectro de atividades biológicas. É crucial para o desenvolvimento, proliferação, sobrevivência e diferenciação de múltiplas células tanto da imunidade inata, quanto da imunidade adaptativa, e apresenta papel essencial na manutenção de células T CD8+ de memória. Nesse trabalho descreveu-se a clonagem do DNA complementar (cDNA) e a expressão de IL-7 e IL-15 recombinantes caninas biologicamente ativas em Escherichia coli. Para expressão em E. coli foram realizadas as clonagens do cDNA de IL-7 e de IL-15 no vetor pRSET, gerando as construções pRSET-caIL-7 e pRSET-caIL-15. O sucesso da clonagem em ambos os vetores de expressão foi confirmado a partir do sequenciamento. As proteínas foram expressas como proteína de fusão com seis moléculas de histidina na extremidade amina da cadeia polipeptídica e após serem solubilizadas com uréia, as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade e renaturadas por diálise. A avaliação da atividade biológica de IL-15 canina purificada foi realizada em células CTLL-2 e foi demonstrada uma relação dose dependente na faixa de concentração proteica de 0,9 ng/mL até 1 µg/mL. O mesmo efeito foi demonstrado quando essas células foram cultivadas na presença de diferentes diluições de T-STIM (controle positivo do ensaio). Visando determinar as condições em que rca-IL-7 e rca-IL-15 são capazes de induzir efeitos biológicos in vitro, foram realizados experimentos com diferentes doses de ambas as citocinas e demonstrado pela primeira vez que tanto IL-7 quanto IL-15 são capazes de induzir a proliferação de CMNSP de cães pré-ativadas com PHA. Adicionalmente, as citocinas foram avaliadas quanto à capacidade de estimulação da proliferação de CMNSP de cães sem estímulo prévio ou concomitante e foi possível observar que rca-IL-7 foi capaz de manter a proliferação dessas células por até 12 dias de cultivo, enquanto rca-IL-15 foi capaz de fazê-lo por até 14 dias. Diante dos resultados obtidos a rca-IL-7 e rca-IL-15 poderão ser utilizadas no futuro em estudos que visam o estabelecimento de uma resposta de longa duração em cães com LVC submetidos à quimioterapia convencional. / Most dogs with LV subjected to conventional chemotherapy has relapsed after discontinuation of treatment, possibly due these animals develop specific cellular immune response transiently. Since IL-7 and IL-15 are described in the literature asbeing capable of promoting cellular immune response of long-term (memory), this study aimed at cloning, expression and biological activity evaluation of rca-IL7 and rca IL-15. Many studies have demonstrated the essential role of IL-7 and IL- 15 in the homeostasis of T-cells. The Interleukin-7 is a growth and anti-apoptotic factor of T lymphocytes, essential for the occurrence of mature, naive, and memory T cells, especially CD4+. IL-15 presents a wide spectrum of biological activities. It is crucial for the development, proliferation, survival, and differentiation of multiple cells of innate immunity as well as of adaptive immunity, and presents an essential role in the maintenance of CD8+ memory T cells. This work describes the cloning of complementary DNA (cDNA) and the expression of IL-7 and IL-15 canine recombinants biologically active in Escherichia coli. For expression in E. coli, we cloned cDNA of IL-7 and IL- 15 in the vector pRSET, generating the constructions pRSET-caIL7 and pRSETcaIL- 15. The success of the cloning in both the expression vectors was confirmed from the sequencing. The proteins were expressed as fusion protein with six molecules of histidine in the amine extremity of the polypeptide chain and afterwards were solubilized with urea, the proteins were purified by affinity chromatography and renatured by dialysis. The evaluation of the biological activity of purified canine IL-15 was achieved in CTLL-2 cells and a dose-dependent relation in the range of protein concentration of 0.9 ng/mL to 1 ƒÊg/mL was demonstrated. The same effect was demonstrated when these cells were cultivated in the presence of different dilutions of T-STIM (positive control of the test). With the goal of determining the conditions in which rca-IL-7 and rca-IL-15 are capable of inducing biological effects in vitro, we carried out experiments with different doses with both the cytokines and demonstrated for the first time that IL-7 as well as IL- 15 are capable of inducing proliferation of PBMC of dogs pre-activated with PHA. Also, the cytokines were evaluated as to the capacity of stimulation of the proliferation of PBMC of dogs without previous or concomitant stimulation and it was possible to observe that rca-IL-7 was capable of maintaining the proliferation of these cells for up to 12 days of cultivation, while rca-IL-15 was capable of doing it for 14 days. Considering the results obtained rca-rca-7 and IL-IL-15 may be used in future studies that aim to establish a long-termresponse in dogs with CVL undergoing conventional chemotherapy

Orientadores: José Andrés Yunes, Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T20:56:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zenatti_PriscilaPini_D.pdf: 14781518 bytes, checksum: 2324b48b89768b42bcd5bf002d30a510 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A IL-7 é uma citocina essencial para o desenvolvimento, sobrevivência, e proliferação dos timócitos prematuros normais no timo e linfócitos T maduros nos órgãos linfoides periféricos. O receptor da IL-7 é um heterodímero constituído pela IL-7Ra (codificado pelo gene IL7R) e IL-2Ry. A IL-2Ry participa também dos receptores da IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 e IL-21, sendo por isso conhecida como cadeia comum gama ou yc. A sinalização via IL-7 é imprescindível para o processo de rearranjo V(D)J dos receptores de células T (TCR), pois leva à modificação da cromatina que permite o acesso da recombinase aos loci TCR no DNA Camundongos defeituosos para a cadeia alfa do receptor da IL-7 (IL-7Ra) desenvolvem imunodeficiências devido à falta de células T. A via IL-7/IL-7Ra é também importante para proliferação e sobrevivência da leucemia linfóide aguda de células T (LLA-T). Suspeitando da existência de mutações em IL7R resultando em ganho de função e hiperativação da via IL-7/IL-7Ra, procurou-se por mutações no gene do IL-7Ra em mais de 50 casos de LLA-T pediátrica. Procurou-se também mutações no domínio de autoinibição das JAK1 e JAK3, moléculas associadas ao IL-7Ra e IL-2Ry, respectivamente. Aproximadamente 9% das LLA-T pediátricas apresentaram mutações no IL-7Ra, resritas a uma região estreita do éxon 6, que resultaram, na maioria dos casos, em inserções de uma cisteína no domínio transmembrana/justamembrana da proteína. A presença dessa cisteína leva à homodimerização das cadeias IL-7Ra mediante a formação de pontes de dissulfeto e à ativação constitutiva do IL-7Ra independente de seu ligante, conforme verificado pela fosforilação de JAK1, STAT5, AKT e BAD e análise de mutantes artificiais do IL-7Ra com subtração ou adição de resíduo de cisteína. Verificou-se também que o local de inserção da cisteína é crítico para que a homodimerização das cadeias IL-7Ra mutantes resulte em ativação da via JAK/STAT. Receptores imitados tiveram um efeito transformante nas linhagens celulares Dl e Ba/F3, que sobreviveram na ausência dos fator de crescimento IL-7 e IL-3, respectivamente. Além disso, células Dl transduzidas com IL7R mutante, quando injetadas em camundongos knockout (KO) para IL7, causaram esplenomegalia, metástase e tumor no local da injeção. Resultados semelhantes foram obtidos com a expressão ectópica do IL7R mutante em células progenitoras hematopoiéticas de camundongos knockout para IL7R, JAK3 e/ou IL2RG, demonstrando que o homodímero IL-7Ra mutante atua independentemente dessas moléculas. Em conclusão, mutações no IL7R contribuem para a leucemogenese em 9% das crianças com LLA-T. Espera-se que a melhor caracterização do mecanismo responsável pela ativação constitutiva do IL-7Ra mutante abra caminho para o desenho de novas drogas e anticorpos monoclonais, o que permitirá avaliar o valor terapêutico do bloqueio/inibição do IL-7Ra mutante nas LLA-T / .Abstract: The IL-7, a product of stromal cells, is normally required for T cells development and for survival of mature peripheral T cells. The IL-7R consists of two components, the IL-7Ra (encoded by IL7R) and the common gamma chain (yc), or IL-2Ry, that is shared by receptors for IL-2, IL-4, IL-9, IL-15 and IL-21. The IL-7 signaling has a role in V(D)J recombination in developing T and B cells by controlling access of the V(D)J recombinase to the locus. IL-7Ra deficiency mice showed a diminished T cell number and impaired lymphocyte development. Further, the IL-7/IL-7Ra pathway is important for T-acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) proliferation and survival. Hypothesizing that IL7R gain-of-function mutation could be occurring in T-ALL, 50 T-ALL samples were analyzed for mutations. The kinases JAK1 and JAK3, mat are associated with IL-7Ra and yc, respectively, were also studied for mutations. About 9% of childhood T-ALL presented mutations at the transmembrane domain encoded by éxon 6, and all of mem were in-frame insertions and deletions. In all but three cases there was an insertion of cysteine mat is essential for disulfide bond formation and constitutive activation of the receptor independent of IL-7. The constitutive signaling was confirmed by phosphorylation of JAK1, STAT5, AKT and BAD, and analysis of IL-7Ra artificial mutants with or without cysteine. The position of cysteine insertion is very important to disulfide bond formation, to activate the JAK/STAT pathway and to support the proliferation of Ba/F3 and Dl cell lines in the absence of cytokine. Moreover, IL7R mutant transduced Dl cells injected into ILT1' mice caused splenomegaly, metastasis and tumor at the injection site. Similar results were obtained with the ectopic expression of the IL7R mutant in hematopoietic progenitor cells of IL7K1', JAK3'1' and/or IL2RG'1' mice, demonstrating that the mutant homodimer IL-7Ra operates independently of these molecules. In conclusion, mutations in ÚÍQIL7R contribute to leukemo genes is in 9% of children with ALL-T. We hope mat a better comprehension of the mechanism responsible for the constitutive activation of IL-7Ra mutant opens new perspectives into the design of new drugs and monoclonal antibodies, which may turn into valuable therapeutic treatment / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

INTRODUÇÃO: A Síndrome de Sézary (SS) é um linfoma cutâneo de células T (LCCT), caracterizado por eritrodermia, linfadenopatia generalizada e presença de células tumorais na pele, linfonodos e sangue periférico. Os linfócitos TCD8+ têm papel fundamental na resposta imune antitumoral, entretanto, há escassos estudos evidenciando seu perfil fenotípico e funcional. Considerando que a resposta imunológica do paciente com SS está suprimida, estratégias para potencializar a imunidade inata e adaptativa com agonistas de receptores Toll-like (TLRs) têm sido exploradas. OBJETIVO: Caracterizar o perfil de marcadores de ativação/inibição das células TCD8+, seus estágios de diferenciação, capacidade de resposta a IL-7/IL-15 e ao agonista de TLR7/TLR8 de pacientes com SS. METODOLOGIA: Foram selecionados 15 pacientes com SS (7 homens e 8 mulheres) com 48-85 anos do Ambulatório de Linfomas Cutâneos, do HC-FMUSP, e um grupo de controle com 24 indivíduos sadios. A análise de marcadores de ativação/inibição e diferenciação celular em células TCD4/TCD8+ do sangue periférico foi realizada por citometria de fluxo. A expressão de marcadores extracelulares e citocinas intracelulares em células mononucleadas do sangue periférico (CMN) após estimulação com o agonista de TLR7/TLR8 foi analisada por citometria de fluxo. Além disto, o efeito de IL-7 e IL-5 em células T foi avaliado pela fosforilação de STAT5, na capacidade de proliferação mitogênica e expressão de BCL-2 em CMNs, como também pelos níveis séricos de IL-7 por citometria de fluxo. RESULTADOS: Os pacientes com SS mostram perfil fenotípico de ativação crônica nos linfócitos TCD8+ periféricos, decorrente do elevadopercentual de células TCD8+ CD38+, redução percentual de TCD8+ CD127+ (IL-7R) e da população naive. Além disso, ocorreu aumento de expressão de PD-1 na população naive de células TCD8+. O marcador de ativação, CD26, até então apenas relacionado com linfócitos TCD4, foi detectado em reduzida percentagem de linfócitos TCD8. A resposta para IL-7/IL-15 parece estar funcionalmente presente tanto nos linfócitos TCD4 quanto nos linfócitos TCD8. Contudo, foi encontrado um perfil diferenciado e heterogêneo de fosforilação de STAT5 assim como de expressão de BCL-2 nos linfócitos TCD8+ de pacientes com SS. O nível sérico de IL-7 reduzido dos pacientes com SS foi inversamente correlacionado com o número absoluto de linfócitos TCD4+. CONCLUSÃO: Os linfócitos TCD8+ dos pacientes com SS encontram-se reduzidos em números absolutos, e possuem um perfil alterado de diferenciação celular e expressão de marcadores extracelulares. A redução percentual da população de TCD8+ naive associada com a presença de moléculas de ativação crônica mostra um perfil de imunosenescência. As células TCD8+ exibem baixa capacidade de resposta aos ligantes de TLR intracelulares, provavelmente devido ao perfil de ativação crônica. Além disso, há resposta parcial dos linfócitos TCD8+ às citocinas ligantes do receptor yc. Nossos resultados evidenciam alterações em linfócitos TCD8+ que debilitam a resposta imune antitumoral e que pode contribuir com a patogênese da síndrome de Sézary / INTRODUCTION: Sézary syndrome (SS) is a cutaneous T cell lymphoma (CTCL), characterized by erythroderma, generalized lymphadenopathy and the presence of tumor cells in the skin, lymph nodes and peripheral blood. The TCD8+ lymphocytes play a key role in anti-tumor immune response, whereas, there are few studies showing its phenotypic and functional profile in SS. Considering that the immune response of SS patient is suppressed, strategies to enhancing the innate and adaptive immunity by Toll-like receptors (TLRs) agonists have been explored. OBJECTIVE: To characterize the profile of activation/inhibition markers of CD8+ T cells, their stages of differentiation, ability of response to IL-7/IL-15 and TLR7/TLR8 agonist of patients with SS. METHODOLOGY: Fifteen SS patients were enrolled (7 men and 8 woman) with 48-85 years from the Clinic of Cutaneous Lymphomas, HC-FMUSP, and a control group of 24 healthy individuals. Analysis of activation/inhibition markers and cellular differentiation in CD4/CD8 T cells from peripheral blood were assessed by flow cytometry. The expression of extracellular markers and intracellular cytokines in mononuclear cells in the peripheral blood (CMN) were evaluated by flow cytometry. Moreover, the effect of IL-7 and IL-15 stimulation in T cells was assessed by the STAT5 phosphorylation, proliferative mitogenic capacity, BCL-2 expression in CMNs as well as serum IL-7 levels by flow cytometry. RESULTS: Patients with SS show a phenotypic CD8 T peripheral lymphocytes profile of chronic activation, due to the high percentage of CD8+CD38+ T cells, reduced percentage of CD8+CD127+ (IL-7R) and naïve population. Furthermore, it was observed an increased PD-1 expression in the naïve CD8+ T cells. The activation marker CD26, previously only associated with CD4 T lymphocyte, was detected at decreased percentage in CD8 T lymphocytes. The TLR7/TLR8 agonist did not affect the IFN-? and TNF secretion of CD8 T lymphocytes of SS patients, in contrast to the control group. The response to IL-7/IL-15 appears to be functional in both CD4 and CD8 T lymphocytes. However, it was founded a differentiated and heterogeneous profile of STAT5 phosphorylation and Bcl-2 expression in the CD8 T lymphocytes in SS patients. The reduced IL-7 serum of patients with SS was inversely correlated with the absolute number of CD4 T lymphocytes. CONCLUSION: CD8 T lymphocytes of patients with SS are reduced in absolute numbers, and show an altered cellular differentiation profile and extracellular markers expression. The reduced percentage of CD8 naïve population associated with chronic activation of molecules reveals an immunosenescence profile. The CD8 T cells exhibit low ability to ligands of intracellular TLR receptors, probably due to chronic activation profile. In addition, there are partial response of CD8 T lymphocytes to the cytokine receptor ?c. Our results show disturbance in CD8 T lymphocytes that may impair the anti-tumor response contributing to the pathogenesis of Sézary syndrome

INTRODUÇÃO: A Síndrome de Sézary (SS) é um linfoma cutâneo de células T (LCCT), caracterizado por eritrodermia, linfadenopatia generalizada e presença de células tumorais na pele, linfonodos e sangue periférico. Os linfócitos TCD8+ têm papel fundamental na resposta imune antitumoral, entretanto, há escassos estudos evidenciando seu perfil fenotípico e funcional. Considerando que a resposta imunológica do paciente com SS está suprimida, estratégias para potencializar a imunidade inata e adaptativa com agonistas de receptores Toll-like (TLRs) têm sido exploradas. OBJETIVO: Caracterizar o perfil de marcadores de ativação/inibição das células TCD8+, seus estágios de diferenciação, capacidade de resposta a IL-7/IL-15 e ao agonista de TLR7/TLR8 de pacientes com SS. METODOLOGIA: Foram selecionados 15 pacientes com SS (7 homens e 8 mulheres) com 48-85 anos do Ambulatório de Linfomas Cutâneos, do HC-FMUSP, e um grupo de controle com 24 indivíduos sadios. A análise de marcadores de ativação/inibição e diferenciação celular em células TCD4/TCD8+ do sangue periférico foi realizada por citometria de fluxo. A expressão de marcadores extracelulares e citocinas intracelulares em células mononucleadas do sangue periférico (CMN) após estimulação com o agonista de TLR7/TLR8 foi analisada por citometria de fluxo. Além disto, o efeito de IL-7 e IL-5 em células T foi avaliado pela fosforilação de STAT5, na capacidade de proliferação mitogênica e expressão de BCL-2 em CMNs, como também pelos níveis séricos de IL-7 por citometria de fluxo. RESULTADOS: Os pacientes com SS mostram perfil fenotípico de ativação crônica nos linfócitos TCD8+ periféricos, decorrente do elevadopercentual de células TCD8+ CD38+, redução percentual de TCD8+ CD127+ (IL-7R) e da população naive. Além disso, ocorreu aumento de expressão de PD-1 na população naive de células TCD8+. O marcador de ativação, CD26, até então apenas relacionado com linfócitos TCD4, foi detectado em reduzida percentagem de linfócitos TCD8. A resposta para IL-7/IL-15 parece estar funcionalmente presente tanto nos linfócitos TCD4 quanto nos linfócitos TCD8. Contudo, foi encontrado um perfil diferenciado e heterogêneo de fosforilação de STAT5 assim como de expressão de BCL-2 nos linfócitos TCD8+ de pacientes com SS. O nível sérico de IL-7 reduzido dos pacientes com SS foi inversamente correlacionado com o número absoluto de linfócitos TCD4+. CONCLUSÃO: Os linfócitos TCD8+ dos pacientes com SS encontram-se reduzidos em números absolutos, e possuem um perfil alterado de diferenciação celular e expressão de marcadores extracelulares. A redução percentual da população de TCD8+ naive associada com a presença de moléculas de ativação crônica mostra um perfil de imunosenescência. As células TCD8+ exibem baixa capacidade de resposta aos ligantes de TLR intracelulares, provavelmente devido ao perfil de ativação crônica. Além disso, há resposta parcial dos linfócitos TCD8+ às citocinas ligantes do receptor yc. Nossos resultados evidenciam alterações em linfócitos TCD8+ que debilitam a resposta imune antitumoral e que pode contribuir com a patogênese da síndrome de Sézary / INTRODUCTION: Sézary syndrome (SS) is a cutaneous T cell lymphoma (CTCL), characterized by erythroderma, generalized lymphadenopathy and the presence of tumor cells in the skin, lymph nodes and peripheral blood. The TCD8+ lymphocytes play a key role in anti-tumor immune response, whereas, there are few studies showing its phenotypic and functional profile in SS. Considering that the immune response of SS patient is suppressed, strategies to enhancing the innate and adaptive immunity by Toll-like receptors (TLRs) agonists have been explored. OBJECTIVE: To characterize the profile of activation/inhibition markers of CD8+ T cells, their stages of differentiation, ability of response to IL-7/IL-15 and TLR7/TLR8 agonist of patients with SS. METHODOLOGY: Fifteen SS patients were enrolled (7 men and 8 woman) with 48-85 years from the Clinic of Cutaneous Lymphomas, HC-FMUSP, and a control group of 24 healthy individuals. Analysis of activation/inhibition markers and cellular differentiation in CD4/CD8 T cells from peripheral blood were assessed by flow cytometry. The expression of extracellular markers and intracellular cytokines in mononuclear cells in the peripheral blood (CMN) were evaluated by flow cytometry. Moreover, the effect of IL-7 and IL-15 stimulation in T cells was assessed by the STAT5 phosphorylation, proliferative mitogenic capacity, BCL-2 expression in CMNs as well as serum IL-7 levels by flow cytometry. RESULTS: Patients with SS show a phenotypic CD8 T peripheral lymphocytes profile of chronic activation, due to the high percentage of CD8+CD38+ T cells, reduced percentage of CD8+CD127+ (IL-7R) and naïve population. Furthermore, it was observed an increased PD-1 expression in the naïve CD8+ T cells. The activation marker CD26, previously only associated with CD4 T lymphocyte, was detected at decreased percentage in CD8 T lymphocytes. The TLR7/TLR8 agonist did not affect the IFN-? and TNF secretion of CD8 T lymphocytes of SS patients, in contrast to the control group. The response to IL-7/IL-15 appears to be functional in both CD4 and CD8 T lymphocytes. However, it was founded a differentiated and heterogeneous profile of STAT5 phosphorylation and Bcl-2 expression in the CD8 T lymphocytes in SS patients. The reduced IL-7 serum of patients with SS was inversely correlated with the absolute number of CD4 T lymphocytes. CONCLUSION: CD8 T lymphocytes of patients with SS are reduced in absolute numbers, and show an altered cellular differentiation profile and extracellular markers expression. The reduced percentage of CD8 naïve population associated with chronic activation of molecules reveals an immunosenescence profile. The CD8 T cells exhibit low ability to ligands of intracellular TLR receptors, probably due to chronic activation profile. In addition, there are partial response of CD8 T lymphocytes to the cytokine receptor ?c. Our results show disturbance in CD8 T lymphocytes that may impair the anti-tumor response contributing to the pathogenesis of Sézary syndrome

O Diabetes Mellitus tipo 1 (DM1A) é uma doença autoimune caracterizada pela infiltração pancreática de linfócitos T e B, macrófagos e células dendríticas, levando à perda progressiva da capacidade de secreção de insulina pelas células beta pancreáticas. A homeostase das células T, ou seja, o desenvolvimento e manutenção apropriados dos números e funções das células T são essenciais para a integridade do sistema imune. Classicamente acreditava-se que as células T CD4+ poderiam se subdividir em duas populações efetoras distintas, T helper 1 e T helper 2. Recentemente, foram descritas duas novas vias de ativação de linfócitos T CD4+: a via Th17, que tem papel fundamental na autoimunidade; a via T regulatória, onde células T CD4+CD25+ high são essenciais na tolerância periférica e proteção contra autoimunidade. As Interleucinas (IL) de cadeia gama comum agem em várias etapas desta diferenciação linfocítica. A IL-21 é o membro mais recente desta família de citocinas, que inclui também: IL-2, IL-4, IL-7 , IL-9 e IL-15. A IL-21 atua através da interação com seu receptor, o IL-21R, apresentando ações pleiotrópicas e, como regra, pró-inflamatórias. Em estudos com modelos animais de diabetes autoimune verificou-se que a IL-21 e seu receptor são essenciais para o desenvolvimento da doença, porém ainda não há estudos sobre a ação desta interleucina no DM1 em humanos. O objetivo de nosso estudo foi avaliar o papel dos receptores das interleucinas de cadeia gama comum na patogênese do DM1A através da determinação da expressão da proteína de superfície e do RNA mensageiro destes receptores em pacientes com DM1A de início recente, em comparação com indivíduos controles normais, e da correlação destes valores com títulos de autoanticorpos pancreáticos. Estudamos a expressão da proteína de superfície do IL-21R, IL-2R (CD25), IL-2R (CD122), IL-4R (CD124) e IL-7R (CD127) em linfócitos T periféricos de 35 pacientes com DM1 e 25 controles sadios utilizando citometria de fluxo. O tempo médio de diagnóstico do DM1 foi de 3 meses, e todos os pacientes estavam em uso de insulina no momento da coleta de sangue. Auto-anticorpos pancreáticos (anti-GAD65 e anti-IA2) foram dosados através de radioimunoensaio. A expressão do RNAm de IL-21R, IL-2R e IL-2R foi quantificada por PCR em tempo real em 23 dos pacientes portadores de DM1A. Detectamos, pela primeira vez, diminuição significativa na expressão proporcional de IL-21R, CD25 e CD122 em linfócitos TCD3+ e TCD4+, além de diminuição na expressão de CD124 em linfócitos T CD4+ e CD127 em linfócitos T CD3+. Verificamos também redução significativa na quantidade de células TCD4+CD25+high (T regulatórias) nos pacientes DM1A. Não houve correlação entre expressão dos receptores de superfície das interleucinas de cadeia gama comum e títulos de autoanticorpos pancreáticos. Realizamos o PCR em tempo real para quantificar a expressão do RNA mensageiro (RNAm) dos receptores de interleucinas de cadeia gama comum, e avaliar se esta correspondia à expressão das proteínas de superfície obtida através de citometria de fluxo. Comparamos a expressão do RNAm de IL-21R, IL-2R e IL-2R nos pacientes DM1A dividindo-os em tercis de acordo com os valores de expressão de proteína de superfície obtidos por citometria de fluxo em linfócitos T CD3+, e verificamos que não houve diferença entre os 3 grupos na expressão relativa dos genes estudados. Portanto, em nossa casuística a redução da expressão da proteína de superfície dos receptores de interleucinas de cadeia gama comum possivelmente decorreu de alterações posteriores à transcrição do RNA mensageiro / Type 1 diabetes (T1D) is a chronic autoimmune disease characterized by pancreatic infiltration of T and B lymphocytes, macrophages and dendritic cells, leading to a progressive destruction of the insulin-producing -cells. Homeostasis of T cells can be defined as the ability of the immune system to maintain normal T-cell counts and to restore T-cell numbers following T-cell depletion or expansion. It was classically believed that the CD4+ T cells could be activated into two distinct effector populations, T helper1 and T helper2. It was recently described two new pathways of CD4+ T lymphocytes activation: the Th17 pathway, that plays a fundamental role in autoimmunity and the regulatory pathway (Treg), where CD4+CD25+high T cells are essential to maintain peripheral tolerance and therefore protect against autoimmunity. The common gamma chain cytokines interfere with several steps of the CD4+ T lymphocytes differentiation. Interleukin-21 (IL-21) is the most recent member of this family, that also includes IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 and IL-15, and has pleiotropic effects on the immune system. Interleukin-21 acts through interaction with its receptor, the IL-21R, which is expressed in a great variety of immune cells. Various studies with animal models of autoimmune diabetes demonstrated that IL-21 and its receptor are essential for the development of the disease, but there are no studies evaluating the role of this interleukin and its receptor in T1DM in humans. The aim of our study was to assess the role of common gamma chain-dependent cytokine receptors in the pathogenesis of T1D, by determining the expression of the surface protein and mRNA of these receptors in recent-onset T1D patients and correlating these values with titles of pancreatic autoantibodies. We studied the surface protein expression of IL-21R, IL-2R (CD25), IL-2R (CD122), IL-4R (CD124) and IL-7R (CD127) in peripheral T lymphocytes of 35 patients with T1D and 25 healthy controls using flow cytometry. Mean T1D duration was 3 months and all patients were using insulin at the time of blood withdraw. Pancreatic autoantibodies (anti-GAD65 and anti-IA2) were assessed by radioimmunoassay. The mRNA expression of IL-21R, IL-2R and IL-2R was quantified by real time PCR in 23 of the T1D patients. We detected for the first time a statistically significant decrease in the proportional expression of IL-21R, CD25 and CD122 on CD3+ and CD4+ T lymphocytes, a decrease in the expression of CD124 on CD4+ T cells and CD127 on CD3+ T lymphocytes. We also observed a significant reduction in the amount of CD4+ CD25+high (T regulatory cells) in T1D patients. There was no correlation between the expression of the surface receptors of common gamma chain cytokines and titles of pancreatic autoantibodies. We performed real-time PCR to quantify RNA expression of common gamma-chain interleukin receptors, and evaluate if these values corresponded to those of surface proteins obtained using flow cytometry. We compared the mRNA expression of IL-21R, IL-2R and IL-2R in T1D patients by dividing them into tertiles according to the expression values of surface protein obtained by flow cytometry in CD3+T lymphocytes. We observed that there was no difference in the relative expression of mRNA among the 3 groups of patients. Therefore, in our study, the reduction of surface protein expression of common gamma chain cytokines receptors was possibly due to alterations that occurred after the transcription of mRNA

Uma das principais complicações inerentes ao transplante de células-tronco hematopoiéticas é a doença do enxerto contra hospedeiro (DECH), que se trata da resposta imunológica contra os tecidos do receptor pelas células T do doador contidas no transplante. Este quadro é responsável por 15-30% das mortes que ocorrem após o transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas. Apesar dos recentes avanços para reduzir a incidência de DECH através de alternância de regimes profiláticos reduzindo a intensidade do condicionamento, são poucos os tratamentos efetivos. Recentemente, o potencial imunomodulador das células-tronco mesenquimais tornou-se o foco de vários estudos. Alguns autores descreveram a atuação destas células na redução da resposta imunológica através da inibição da proliferação de células T, representando um novo potencial terapêutico para DECH. Mediante esse conhecimento, investigamos o papel das células-tronco mesenquimais na proliferação, apoptose e na produção de citocinas por linfócitos T. Nossos resultados mostraram que a presença de células-tronco mesenquimais nas culturas regulam negativamente a proliferação de linfócitos T estimulados de forma independente de contato e a apoptose de forma parcialmente dependente de contato. Observamos também que linfócitos T virgens em diferenciação para Th17 na presença de células-tronco mesenquimais apresentam redução na capacidade de produzir duas importantes citocinas efetoras implicadas na DECH, o interferon gama (IFN-y) e a interleucina 17A (IL-17A). Investigamos se a prostaglandina E2 (PGE2), por depletar triptofano, estava envolvida com a diminuição de proliferação de linfócitos T quando em cultivo com células-tronco mesenquimais. Utilizamos nas culturas a indometacina (IDT), um anti-inflamatório bloqueador de cicloxigenase (COX 1 e 2) e portanto da via da PGE2. Entretanto, observamos que o bloqueio da via da PGE2 inibia ainda mais a proliferação de linfócitos T e isto ocorria de acordo com a dose de IDT. Com o resultado deste experimento concluímos que, se a proliferação de linfócitos é inibida pela depleção de triptofano do meio, ela não ocorre via PGE2. Entretanto ainda não conseguimos esclarecer se esta via é ativada por outras moléculas, ou se é esta a via realmente responsável pela inibição da proliferação de linfócitos. No que concerne a via de inibição de apoptose, mostramos que a cadeia alpha do receptor de IL-7 (CD127) está aumentada na superfície de linfócitos T quando em presença de células-tronco mesenquimais. Verificamos que o bloqueio de IL-7 nas culturas aumenta a apoptose em linfócitos, bem como sua adição causa diminuição de apoptose. Identificamos a produção intracelular de IL-7 nas células-tronco mesenquimais, relacionando estas células e IL-7 com a inibição de apoptose em linfócitos T nestas condições. Este trabalho gerou dados que permitiram a compreensão de alguns possíveis mecanismos pelos quais as MSCs podem atuar sobre linfócitos T ativados e/ou alorreativos; mecanismos estes que podem ser utilizados como base para futuras investigações na elucidação e prevenção da DECH / A major complication after hematopoietic stem cell transplantation is the graft versus host disease (GVHD), which is an immunological response of transplanted donor T cells against the recipient tissues; this outline is responsible for 15-30% of deaths that can occur after allogeneic hematopoietic stem cells transplant. Despite recent advances in reducing GVHD incidence by alternating prophylactic regimens, thus reducing the intensity of conditioning, there are few effective treatments. Recently, the immune modulatory potential of mesenchymal stem cells has become the focus of several studies. Some authors described the role of these cells in reducing immune response by inhibiting T cell proliferation, representing a potential new therapy for GVHD. Through this knowledge, we investigated the mesenchymal stem cells role into T lymphocytes proliferation, apoptosis and cytokine production. Our results showed that the presence of mesenchymal stem cells into the cultures downregulates the proliferation of stimulated lymphocytes independent of contact and apoptosis of stimulated lymphocytes in partially contact-dependent manner. We also observed during naive T lymphocytes differentiation into Th17 cells, that the mesenchymal stem cell presence reduces the lymphocyte ability in producing the GVHD major effectors cytokines, interferon gamma (IFN-y) and interleukin-17A (IL-17A). We investigated whether prostaglandin E2 (PGE2) was involved in the reduction of T lymphocytes proliferation, when cultured with mesenchymal stem cells, by tryptophan depletion. Indomethacin (IDT), an anti-inflammatory drug blocker of cyclooxygenase (COX 1 and 2) and therefore PGE2 pathway, was used. However, we observed that, according to IDT dose, blocking this pathway further inhibited lymphocyte proliferation. With this result we conclude that if lymphocyte proliferation is inhibited by tryptophan depletion, it does not occur via PGE2. However, we still cannot say whether this pathway is activated by other molecules, or if this pathway is actually responsible for T lymphocytes proliferation inhibition. Regarding the apoptosis inhibition in T lymphocytes, we show that the IL-7 receptor alpha chain (CD127) is increased on the surface of T lymphocytes when in the presence of mesenchymal stem cells. We found that IL-7 blockage in the cultures increases apoptosis in T lymphocytes, as well as their addition causes apoptosis decrease. We also identified the intracellular production of IL-7 on mesenchymal stem cells, linking these cells and IL-7 directly with apoptosis inhibition in T lymphocytes under these conditions This work has generated data that allowed the understanding of some possible mechanisms by which MSCs can act on activated and/or alloreactive T lymphocytes; mechanisms that can be used as a basis for future research in the elucidation and prevention of GVHD

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is ranked as the most serious parasitic disease in Latin America and has become a worldwide problem. A bulk of studies substantiates that Th1-associated cytokines are essential elements in early resistance against the parasite and are associated with the development of the chronic cardiac form. Although cytokines have a key role in the immune response against T. cruzi, little is known about IL-3, IL-7 and IL-9 in this context. Then the aim of this study was to analyze the role of IL-3, IL-7 and IL-9 in the acute phase of T. cruzi experimental infection. For this purpose, parameters indicative of improvement in clinical status of the animals both infected and treated as just treated were studied, such as: morbidity, mortality and histopathology. The amount of cardiac mast cells and the serum cytokines profile were also evaluated. Our data revealed that the treatment with IL-3, IL-7 or IL-9 did not alter the clinical parameters analyzed or the amount of cardiac mast cells in mice infected with T. cruzi. However the treatment with IL-3 decreased the cardiac T. cruzi-induced inflammation and the treatment with IL-7 increased serum levels of IL-5 in infected animals. In addition, the treatment with IL-9 increased the serum levels of Th1 cytokine profile (IL-2, IFN-y and TNF-α) and decreased cardiac fibrosis in infected animals, suggesting a possible protective role of this cytokine in this context. Taken together, our results underline the importance of these cytokines in modulation of T. cruzi infection. Since studies involving IL-3, IL-7 and IL-9 activity during Chagas disease are critical in understanding the parasite control process and the protective and/or harmful action of these cytokines in the host. In addition, understanding of the immunological mechanisms mediated by these cytokines that are involved in disease development may contribute to the establishment of new therapeutic interventions to prevent Chagas disease and treat their symptomatic forms. / A Doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é classificada como a doença parasitária mais grave da América Latina e tornou-se um problema mundial. A maior parte dos estudos confirma que as citocinas de perfil Th1 são elementos essenciais na resistência precoce contra o parasita e estão associadas ao desenvolvimento da forma cardíaca crônica. Embora as citocinas tenham um papel chave na resposta imune contra T. cruzi, pouco se sabe a respeito da função de IL-3, IL-7 e IL-9 neste contexto. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar o papel destas citocinas na fase aguda da infecção experimental com T. cruzi. Para isto, parâmetros indicativos de melhora clínica dos animais tanto infectados e tratados como apenas tratados foram estudados, tais como: morbidade, mortalidade e histopatologia. A quantidade de mastócitos cardíacos e o perfil de citocinas séricas também foram avaliados. Os dados revelaram que o tratamento com IL-3, IL-7 ou IL-9 não alterou os parâmetros clínicos analisados nem a quantidade de mastócitos cardíacos nos camundongos infectados com T. cruzi. No entanto, o tratamento com IL-3 diminuiu a inflamação cardíaca T. cruzi-induzida e o tratamento com IL-7 aumentou os níveis séricos de IL-5 nos animais infectados. Além disso, o tratamento com IL-9 aumentou os níveis séricos das citocinas de perfil Th1 (IL-2, IFN-y e TNF-α) e diminuiu a fibrose cardíaca nos animais infectados, sugerindo um possível papel protetor desta citocina neste contexto. Em suma, os nossos resultados demonstram a importância destas citocinas na modulação da infecção por T. cruzi. Já que estudos envolvendo a atividade de IL-3, IL-7 e IL-9 durante a doença de Chagas são fundamentais na compreensão sobre o processo de controle parasitário e da ação protetora e/ou prejudicial dessas citocinas no hospedeiro. Além disso, o entendimento dos mecanismos imunológicos mediados por estas citocinas que estão envolvidos no desenvolvimento da doença pode contribuir para o estabelecimento de novas intervenções terapêuticas a fim de prevenir a doença de Chagas e tratar suas formas sintomáticas / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

O Diabetes Mellitus tipo 1 (DM1A) é uma doença autoimune caracterizada pela infiltração pancreática de linfócitos T e B, macrófagos e células dendríticas, levando à perda progressiva da capacidade de secreção de insulina pelas células beta pancreáticas. A homeostase das células T, ou seja, o desenvolvimento e manutenção apropriados dos números e funções das células T são essenciais para a integridade do sistema imune. Classicamente acreditava-se que as células T CD4+ poderiam se subdividir em duas populações efetoras distintas, T helper 1 e T helper 2. Recentemente, foram descritas duas novas vias de ativação de linfócitos T CD4+: a via Th17, que tem papel fundamental na autoimunidade; a via T regulatória, onde células T CD4+CD25+ high são essenciais na tolerância periférica e proteção contra autoimunidade. As Interleucinas (IL) de cadeia gama comum agem em várias etapas desta diferenciação linfocítica. A IL-21 é o membro mais recente desta família de citocinas, que inclui também: IL-2, IL-4, IL-7 , IL-9 e IL-15. A IL-21 atua através da interação com seu receptor, o IL-21R, apresentando ações pleiotrópicas e, como regra, pró-inflamatórias. Em estudos com modelos animais de diabetes autoimune verificou-se que a IL-21 e seu receptor são essenciais para o desenvolvimento da doença, porém ainda não há estudos sobre a ação desta interleucina no DM1 em humanos. O objetivo de nosso estudo foi avaliar o papel dos receptores das interleucinas de cadeia gama comum na patogênese do DM1A através da determinação da expressão da proteína de superfície e do RNA mensageiro destes receptores em pacientes com DM1A de início recente, em comparação com indivíduos controles normais, e da correlação destes valores com títulos de autoanticorpos pancreáticos. Estudamos a expressão da proteína de superfície do IL-21R, IL-2R (CD25), IL-2R (CD122), IL-4R (CD124) e IL-7R (CD127) em linfócitos T periféricos de 35 pacientes com DM1 e 25 controles sadios utilizando citometria de fluxo. O tempo médio de diagnóstico do DM1 foi de 3 meses, e todos os pacientes estavam em uso de insulina no momento da coleta de sangue. Auto-anticorpos pancreáticos (anti-GAD65 e anti-IA2) foram dosados através de radioimunoensaio. A expressão do RNAm de IL-21R, IL-2R e IL-2R foi quantificada por PCR em tempo real em 23 dos pacientes portadores de DM1A. Detectamos, pela primeira vez, diminuição significativa na expressão proporcional de IL-21R, CD25 e CD122 em linfócitos TCD3+ e TCD4+, além de diminuição na expressão de CD124 em linfócitos T CD4+ e CD127 em linfócitos T CD3+. Verificamos também redução significativa na quantidade de células TCD4+CD25+high (T regulatórias) nos pacientes DM1A. Não houve correlação entre expressão dos receptores de superfície das interleucinas de cadeia gama comum e títulos de autoanticorpos pancreáticos. Realizamos o PCR em tempo real para quantificar a expressão do RNA mensageiro (RNAm) dos receptores de interleucinas de cadeia gama comum, e avaliar se esta correspondia à expressão das proteínas de superfície obtida através de citometria de fluxo. Comparamos a expressão do RNAm de IL-21R, IL-2R e IL-2R nos pacientes DM1A dividindo-os em tercis de acordo com os valores de expressão de proteína de superfície obtidos por citometria de fluxo em linfócitos T CD3+, e verificamos que não houve diferença entre os 3 grupos na expressão relativa dos genes estudados. Portanto, em nossa casuística a redução da expressão da proteína de superfície dos receptores de interleucinas de cadeia gama comum possivelmente decorreu de alterações posteriores à transcrição do RNA mensageiro / Type 1 diabetes (T1D) is a chronic autoimmune disease characterized by pancreatic infiltration of T and B lymphocytes, macrophages and dendritic cells, leading to a progressive destruction of the insulin-producing -cells. Homeostasis of T cells can be defined as the ability of the immune system to maintain normal T-cell counts and to restore T-cell numbers following T-cell depletion or expansion. It was classically believed that the CD4+ T cells could be activated into two distinct effector populations, T helper1 and T helper2. It was recently described two new pathways of CD4+ T lymphocytes activation: the Th17 pathway, that plays a fundamental role in autoimmunity and the regulatory pathway (Treg), where CD4+CD25+high T cells are essential to maintain peripheral tolerance and therefore protect against autoimmunity. The common gamma chain cytokines interfere with several steps of the CD4+ T lymphocytes differentiation. Interleukin-21 (IL-21) is the most recent member of this family, that also includes IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 and IL-15, and has pleiotropic effects on the immune system. Interleukin-21 acts through interaction with its receptor, the IL-21R, which is expressed in a great variety of immune cells. Various studies with animal models of autoimmune diabetes demonstrated that IL-21 and its receptor are essential for the development of the disease, but there are no studies evaluating the role of this interleukin and its receptor in T1DM in humans. The aim of our study was to assess the role of common gamma chain-dependent cytokine receptors in the pathogenesis of T1D, by determining the expression of the surface protein and mRNA of these receptors in recent-onset T1D patients and correlating these values with titles of pancreatic autoantibodies. We studied the surface protein expression of IL-21R, IL-2R (CD25), IL-2R (CD122), IL-4R (CD124) and IL-7R (CD127) in peripheral T lymphocytes of 35 patients with T1D and 25 healthy controls using flow cytometry. Mean T1D duration was 3 months and all patients were using insulin at the time of blood withdraw. Pancreatic autoantibodies (anti-GAD65 and anti-IA2) were assessed by radioimmunoassay. The mRNA expression of IL-21R, IL-2R and IL-2R was quantified by real time PCR in 23 of the T1D patients. We detected for the first time a statistically significant decrease in the proportional expression of IL-21R, CD25 and CD122 on CD3+ and CD4+ T lymphocytes, a decrease in the expression of CD124 on CD4+ T cells and CD127 on CD3+ T lymphocytes. We also observed a significant reduction in the amount of CD4+ CD25+high (T regulatory cells) in T1D patients. There was no correlation between the expression of the surface receptors of common gamma chain cytokines and titles of pancreatic autoantibodies. We performed real-time PCR to quantify RNA expression of common gamma-chain interleukin receptors, and evaluate if these values corresponded to those of surface proteins obtained using flow cytometry. We compared the mRNA expression of IL-21R, IL-2R and IL-2R in T1D patients by dividing them into tertiles according to the expression values of surface protein obtained by flow cytometry in CD3+T lymphocytes. We observed that there was no difference in the relative expression of mRNA among the 3 groups of patients. Therefore, in our study, the reduction of surface protein expression of common gamma chain cytokines receptors was possibly due to alterations that occurred after the transcription of mRNA