Orientador: Fausto Viterbo de Oliveira Neto / Resumo: A pesquisa em Biologia Celular, depende de técnicas laboratoriais que possam ser usadas para estudar a estrutura e função celular. Importantes avanços na compreensão das células têm sucedido diretamente o desenvolvimento de novas técnicas, que permitiram novos meios de investigação. Uma grande inovação da indústria biotecnológica é a produção de anticorpos monoclonais que são de extrema importância na área médica. Todas as células do organismo apresentam um conjunto de marcadores de superfície que caracterizam a singularidade biológica e a marca das células que os contêm. Contudo, as células-tronco mesenquimais (CTMs) apresentam poucos marcadores imunofenotípicos específicos, sendo sua caracterização estabelecida pela identificação de um perfil de marcadores específicos e não específicos. Essa imunofenotipagem é realizada com a utilização de anticorpos monoclonais que reconhecem esses antígenos de superfície da membrana celular, conforme demonstrado em estudos contemporâneos. Tendo em vista a inexistência no mercado de testes rápidos para identificação das CTM-TA, optou-se em delinear um projeto que desenvolvesse a ferramenta diagnóstica explorando seu potencial de uso, caracterizando os anticorpos monoclonais previamente produzidos a partir de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo humano utilizando as técnicas de Western blotting e Citometria de fluxo com posterior análise proteômica a fim de identificar a especificidade dos mesmos em um processo de validação e inova... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

COSTA, José Jackson do Nascimento. Expressão de marcadores de células germinativas e de oócitos em fibroblastos bovinos tratados com 5-aza-citidina e em células-tronco adultas cultivadas in vitro na presença de BMP-2, BMP-4 ou fluido folicular. 2016. 207 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-31T20:28:44Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_jjncosta.pdf: 2424368 bytes, checksum: 8fb10f9a05f8f2bc642ce3964eb960d3 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-31T20:29:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_jjncosta.pdf: 2424368 bytes, checksum: 8fb10f9a05f8f2bc642ce3964eb960d3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-31T20:29:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_jjncosta.pdf: 2424368 bytes, checksum: 8fb10f9a05f8f2bc642ce3964eb960d3 (MD5) Previous issue date: 2016 / This study aimed to investigate the effect of 5-Aza-cytidine during induction of pluripotency, and evaluate the effects of culture in medium containing BMP-2, BMP-4 or follicular fluid in the differentiation of fibroblasts in primordias germ cells (CGP) and oocytes (stage 1). Furthermore, isolation of stem cells from the bovine ovarian epithelium and evaluate the effects of BMP-2, BMP-4 or follicular fluid on the differentiation of these stem cells into structures similar to oocytes (stage 2). In phase 1, fibroblasts were treated with 0.5, 1.0 or 2.0 μM of 5-Aza for 18, 36 or 72 h. Morphology cell viability and gene expression (OCT-4, NANOG, SOX2 and REX), were assessed, for the selection of the concentration/time more efficient. The fibroblasts were then cultured in medium supplemented with 10 ng/mL BMP-2 or 10 ng/mL BMP-4 or 5% bovine follicular fluid by 7 or 14 days. Subsequently, evaluation of the morphology and cell viability was taken, and gene expression (VASA, DAZL, c-Kit, SCP3, ZPA and GDF-9). For phase 2, the stem cells of ovarian surface were isolated, expanded, grown in differentiation medium containing 50 ng/mL BMP-2 or 50 ng/mL BMP-4, or BMP-2+BMP-4 or 5% bovine follicular fluid for 14 days. Morphological characteristics, cell viability and expression of alkaline phosphatase and gene expression (VASA, DAZL, C-KIT, SCP3, ZPA and GDF-9), were evaluated. The gene expression results were analyzed using ANOVA followed by Kruskal-Wallis test (P <0.05). In stage 1, the culture with 2.0 μM of 5-Aza for 72 h caused changes in morphology and cell proliferation rate, and significantly increased the expression of pluripotency factors. The culture in medium containing BMP-2, BMP-4 or follicular fluid for 7 or 14 days, altered cellular morphology, and expression of specific genes for stem cells and oocytes. In stage 2, the ovarian stem cells expressed pluripotent genes, and after culture, this cells showed morphologic characteristics similar to PGC and oocytes, including the expression of alkaline phosphatase, and the expression of specific genes for PCG and oocytes. In conclusion, the present study describes the possibility of conversion of the skin fibroblasts and stem cells from ovarian surface of the bovine, in oocyte-like cells, similar oocyte cells, through the cell reprogramming process associated with the supplementation of BMP-2, BMP- 4 and follicular fluid. / Este estudo teve como objetivo investigar o efeito da 5-Aza-citidina durante a indução da pluripotência, e avaliar os efeitos do cultivo em meio contendo BMP-2, BMP-4 ou fluido folicular na diferenciação de fibroblastos em células germinativas primordias (CGP) e oócitos (fase 1). Além disso, isolar células-tronco do epitélio ovariano de bovinos e avaliar os efeitos da BMP-2, BMP-4 ou fluido folicular sobre a diferenciação destas células-tronco em estruturas semelhantes a oócitos (fase 2). Na fase 1, os fibroblastos foram tratados com 0.5, 1,0 ou 2.0 μM de 5-Aza por 18, 36 ou 72 h. Foi avaliada a morfologia, viabilidade celular e a expressão gênica (OCT-4, NANOG, REX e SOX2), para a seleção da concentração/tempo mais eficientes. Os fibroblastos foram então cultivados em meio suplementado com 10 ng/mL de BMP-2, ou 10 ng/mL de BMP-4 ou 5% de fluido folicular bovino, por 7 ou 14 dias. Posteriormente, foi feita a avaliação da morfologia e viabilidade celular, e expressão gênica (VASA, DAZL, C-KIT, SCP3, ZPA e GDF-9). Para a fase 2, as células-tronco da superfície ovariana foram isoladas, expandidas, cultivadas em meio de diferenciação contendo as 50 ng/mL de BMP-2, ou 50 ng/mL de BMP-4, ou BMP-2+BMP-4 ou 5% de fluido folicular bovino por 14 dias. Foram avaliadas as características morfológicas, viabilidade celular, e expressão da fosfatase alcalina e expressão gênica (VASA, DAZL, C-KIT, SCP3, ZPA e GDF-9). Os resultados de expressão gênica foram analisados usando ANOVA seguido pelo Teste de Kruskal Wallis (P<0,05). Na fase 1, o cultivo com 2.0 μM de 5-Aza por 72 h provocou mudanças na morfologia e na taxa de proliferação celular, e aumentou significativamente a expressão de fatores de pluripotência. Já o cultivo em meio contendo BMP-2, BMP-4 ou fluido folicular, durante 7 ou 14 dias, alterou a morfologia celular, e a expressão de genes específicos para células germinativas e oócitos. Na fase 2, as células-tronco do ovário expressaram genes de pluripotência e após o cultivo, as células apresentaram características morfológicas que se assemelhavam a CGP e a células semelhantes a oócitos, incluindo a expressão da fosfatase alcalina e a expressão de genes específicos de células germinativas e oócitos. Em conclusão, o presente estudo descreve a possibilidade de converter os fibroblastos da pele de bovinos e células-tronco da superfície ovariana, em células semelhantes a oócitos, através do processo de reprogramação celular, associado à suplementação do meio com BMP-2, BMP-4 e fluido folicular.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-02-14T20:16:07Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseCelulasTronco.pdf: 5851388 bytes, checksum: acf411c7bf95d660fb3fd48e403b0313 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-02-15T12:51:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseCelulasTronco.pdf: 5851388 bytes, checksum: acf411c7bf95d660fb3fd48e403b0313 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-15T12:51:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseCelulasTronco.pdf: 5851388 bytes, checksum: acf411c7bf95d660fb3fd48e403b0313 (MD5) Previous issue date: 2012 / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / As células-tronco adultas (CTA) são células multipotentes e não especializadas encontradas na medula óssea, no sangue periférico, na córnea, na retina, no cérebro, no músculo esquelético, na polpa dental, no fígado, no pâncreas, no epitélio da pele, no sistema digestivo, no cordão umbilical e na placenta. Estas células podem se renovar e reproduzir indefinidamente e, sob certos estímulos, se transformar em células especializadas de diferentes tecidos ou órgãos. O presente trabalho tem como objetivo a obtenção de CTA a partir de tecido epitelial de roedores silvestres de espécies diferentes (Oecomys concolor - um exemplar fêmea, Proechimys roberti - dois exemplares machos, Hylaeamys megacephalus - dois exemplares machos). A metodologia para isolamento e cultivo in vitro de amostras do tecido epitelial foi estabelecida, a partir de protocolos já descritos, avaliando aspectos morfológicos, estabilidade genômica, contagem e análise da viabilidade celular, potencial clonogênico e indução de diferenciação em osteócitos, condrócitos e adipócitos. Todas essas análises foram feitas pós-criopreservação das culturas. As CTA foram caracterizadas como população homogênea de células que proliferam in vitro, como células aderentes à superfície do plástico, tendo morfologia semelhante a fibroblastos e formato fusiforme, com alta taxa de crescimento e proliferação celular por várias passagens sucessivas, onde a autorrenovação celular foi avaliada por ensaios clonogênicos. Na análise para examinar a estabilidade genômica na P3, todas as amostras apresentaram cariótipo com número diplóide normal e estável. A metodologia empregada nos ensaios para diferenciação das CTA em linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica, apresentou resultados satisfatórios, onde as células mostraram a marcação desejada através das colorações Alizarin Red S, Alcian Blue e Oil Red O, respectivamente. Todas as amostras testadas apresentam capacidade de proliferação e diversidade de diferenciação, sendo potencialmente fornecedores de CTA provenientes da pele e podendo ser utilizados como organismos modelos de estudos em CT. / The Adult Stem Cells (ASC) are non-specialized multipotent cells found in the bone marrow, peripheral blood, cornea, retina, brain, muscles, dental pulp, liver, pancreas, skin epithelium, digestive system, umbilical cord and placenta. These cells can indefinably reproduce and renew themselves and, under some stimulation, to change into specialized cells of different tissues or organs. The present work had the aim of obtaining ASC from epithelial tissues from wild rodents of different species (Oecomys concolor – one female, Proechimys roberti – two males, Hylaeamys megacephalus – two males). The methodology for isolation and in vitro culture of epithelial tissue following the previously described protocols, as well as the analysis after cryopreservation of morphology, genome stability, counting and cells viability, clonogenic potential and differentiation on osteocytes, chondrocytes and adipocytes. The ADC were characterized as a homogeneous population of in vitro growing cells adherent to plastic surfaces, which has a morphology similar to fibroblasts and with fusiform shape, with high growing rate and cell proliferation form many successive passages, where the clonogenic assays evaluated the cell renewing. On checking the genome stability on P3, the entire sample had stable karyotypes with the correct diploid number. The methodology for ASC differentiation into osteocytes, chondrocytes and adipocytes cell lines was satisfactory and the cells demonstrated the staining with Alizarin Red S, Alcian Blue and Oil Red O, respectively. The entire sample had capacity of proliferation and differentiation, being a potential source of skin ASC. These species can be used as models for ASC studies.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-12-04T18:07:06Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_PhysalisAngulataEstimula.pdf: 1429379 bytes, checksum: 5d10074c15a7325c5a8b5b5261afbab6 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-12-05T17:17:38Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_PhysalisAngulataEstimula.pdf: 1429379 bytes, checksum: 5d10074c15a7325c5a8b5b5261afbab6 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-05T17:17:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_PhysalisAngulataEstimula.pdf: 1429379 bytes, checksum: 5d10074c15a7325c5a8b5b5261afbab6 (MD5) Previous issue date: 2013 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / A zona subgranular (ZSG) do giro denteado (GD) de mamíferos adultos é conhecida por produzir constantemente novos neurônios. A busca por novas moléculas que possam modular a formação de novas células neurais são bastante atuais. Visto que a Amazônia é conhecida mundialmente pela sua biodiversidade, com um potencial pouco explorado de fármacos naturais derivados de plantas medicinais típicas da região. O trabalho buscou investigar o efeito neurogênico do extrato aquoso (EA) da Physalis angulata e da substância purificada Fisalina D sobre as células-tronco do GD do hipocampo de camundongos adultos. Os camundongos machos (BALB/c), 6 a 8 semanas de idade foram divididos em quatro grupos experimentais: controle e tratados com EA ou substância purificada. Os animais receberam diferentes doses do extrato (0,1; 1 e 5 mg/Kg) e/ou substância purificada (5mg/Kg) ou salina (grupo controle), 5 horas depois uma única dose de 5-Bromodeoxiuridina (BrdU) [50mg/kg]. Em seguida, os animais foram sacrificados 24 horas ou 7 dias após a administração do BrdU. Os cérebros foram coletados e cortes coronais do hipocampo (40 μm) foram realizados para contagem das células BrdU-positivas no GD hipocampal. Para avaliação estatística realizamos análise de variância (ANOVA) das médias amostrais seguida pelo pós-teste t de Student. O EA promoveu um aumento significativo do número de células BrdU positivas no GD dos grupos tratados em relação ao grupo controle [Controle, 92±24 (n=9); 0,1mg/Kg, 160±22 (n=4); 1mg/Kg, 310±5 (n=4); 5mg/Kg, 501±24 (n=3)] nos animais sacrificados 24 horas após administração do BrdU. Quando os animais foram sacrificados 7 dias após administração do BrdU, o número de células BrdU+ no GD também foi maior no grupo tratado em relação ao controle [Controle, 107±7 (n=4); 5mg/Kg, 145±23 (n=4)]. Usando a substância purificada, Fisalina D, também observamos um aumento do número de células BrdU+ no GD do grupo tratado com a droga em relação ao grupo controle [Controle, 92±24 (n=9); Fisalina D, 5mg/Kg, 316±37 (n=3)]. Este resultado sugere que o EA e a sustância purificada, na dose de 5 mg/Kg, estimulam a proliferação de células BrdU-positivas na ZSG do GD do hipocampo de camundongos adultos. / Aim: Newborn neurons emerge from neural stem cells (NSCs) from niches in the mammalian adult brain. These cells are incorporated into functional circuits and may be important to acquisition and retention of memory. Therefore, the search for new compounds that enhance proliferation and differentiation of neural stem cells in the hippocampus represent a significant scientific challenge with great promise. Methods and results: We have used aqueous extract from of the Physalis angulata on the neurogenesis in the subgranular zone of hipocampal dentate gyrus of adult mice using 5`-bromo-2`-deoxyuridine (BrdU)-pulse chase method. Increased doses (0.1; 1; 5mg/Kg) of Physalis angulata were given to adult male BALB/c mice with 6 to 8-weeks-old; or 0.9% NaCl (control). Mice were sacrificed at 24 hours or 7 days after the BrdU administration, and hippocampal slices were processed for immunohistochemistry. We found that Physalis angulata did not modify the mice behavior at any dose used, but increased the number of BrdU-positive cells in the subgranule zone of hipocampal dentate gyrus 24 hours or 7 days after injection. Physalis angulata not showed BrdU-positive cells out subgranule cell layer (ectopic neurogenesis). All procedures involving animal care and experimentation were performed in accordance with the guidelines of the Ethical Committee for Research with Experimental Animals of the Universidade Federal do Pára (BIO058-12). Conclusion: These results suggest that SM2 could be stimulating the proliferation of neural stem cells in hipocampal dentate gyrus, and also sustain the hipocampal network because increases the BrdU-positive cells in differentiation process in the sub granular zone of hippocampus of adult mice.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:45:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Introdução: Ha um interesse cientifico crescente na plasticidade e potencial terapeutico das celulas-tronco do tecido adiposo humano (CTTAH), celulas multipotentes e abundantes no tecido adiposo que podem se diferenciar in vitro em multiplas linhagens celulares, incluindo adipocitos, condrocitos, osteoblastos, celulas neurais, endoteliais e cardiomiocitos. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito da AII nas CTTAH. Metodos: Celulas precursoras humanas do tecido adiposo foram obtidas de tecido abdominal subcutaneo, separadas por gradiente de centrifugacao por densidade, cultivadas, estimulados com diferentes meios de cultivo e entao analisadas. Resultados: Os resultados de citometria de fluxo evidenciaram a expressao dos marcadores CD73, CD90 e CD105, contrastando com a falta de expressao dos marcadores CD16, CD34 e CD45. A diferenciacao adipogenica, osteogenica e condrogenica tambem foi induzida, confirmando seu potencial de celulas-tronco mesenquimais in vitro As CTTAH foram capazes de se replicar em cultivo mantendo o fenotipo semelhante a fibroblastos in vitro. Quando estimuladas com os diferentes meios de cultivo verificamos que os meios contendo AII aumentaram a atividade celular e mitotica dessas celulas. Conclusao: Com a identificacao da expressao dos receptores AT1 e AT2 e sob acao da AII exogena verificou-se o aumento da atividade celular e mitotica das CTTAH / Introduction: There is a crescent scientific interest about the plasticity and therapeutic potential of adipose-derived stem cells (ASCs), multipotent and abundant cells in adipose tissue, which are able to differentiate in multiple cellular lineages in vitro, including adipocytes, chondrocytes, osteoblasts, neural cells, endothelial and cardiomyocytes. Objective: The aim of this study was verify the effect of AII on ASCs. Methods: Human adipose tissue precursor cells were obtained of subcutaneous abdominal tissue, separated by density centrifugation gradient, cultivated and stimulated with different culture media and, then analysed. Results: The results of flow citometry showed the expression of CD73, CD90 and CD105 markers, constrasting with the lack of expression of CD16, CD34 and CD45 markers. The adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation were also induced, confirming its mesenchymal stem cell potential in vitro. The human ASCs were able to replicate in culture, keeping phenotype similar to fibroblasts in vitro. When stimulated with different culture media, we verified that the media containing AII increased the cellular and mitotic activity of these cells. Conclusion: With the identification of the expression of the AT1 e AT2 receptors and under AII exogenous action, it was verified the increase of cellular activity and mitotic of human ASCs. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-24T13:56:40Z No. of bitstreams: 1 2015-11-doutorado-allan-zimmermann.pdf: 1273033 bytes, checksum: 4c1e3537e5d30d25a69e372778e72de0 (MD5) / Approved for entry into archive by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-06-24T13:59:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015-11-doutorado-allan-zimmermann.pdf: 1273033 bytes, checksum: 4c1e3537e5d30d25a69e372778e72de0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-24T13:59:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015-11-doutorado-allan-zimmermann.pdf: 1273033 bytes, checksum: 4c1e3537e5d30d25a69e372778e72de0 (MD5) Previous issue date: 2015 / Introdução: Os biomateriais utilizados habitualmente em regeneração óssea não possuem potencial osteogênico e osteoindutivo, apesar de possuírem potencial osteocondutivo. Objetivo: Avaliar a associação entre células-tronco mesenquimais do tecido adiposo autólogo (CTM-TAA) e hidroxiapatita na regeneração óssea guiada da calvária de coelhos. Métodos: CTMTAA de seis animais foram associadas à hidroxiapatita e implantadas nas perdas ósseas pós-craniectomias de 12mm criadas bilateralmente na calvária de seis coelhos (grupo experimento - GE). No grupo controle (GC) o material de enxertia foi utilizado sem células. Em cada animal, uma das áreas de perda óssea foi coberta por uma membrana colágena. Após oito semanas os animais foram submetidos a óbito indolor induzido e a região das falhas ósseas avaliadas por histomorfometria. Resultados: O GE apresentou maior quantidade (p < 0,05) do tecido mineralizado vital e não vital (17,0% ± 5,3% e 25,9% ± 4,6%, respectivamente) comparado ao GC (9,8% ± 5,0% e 13,3% ± 2,3%, respectivamente). No GE nenhuma diferença foi observada entre os lados em que foram ou não utilizada as membranas colágenas (p > 0,05). Entretanto, uma diferença estatisticamente significante foi observada para GC (p < 0,05) relativamente à quantidade de tecido mineralizado vital no lado em que a membrana foi utilizadas. Conclusão: A associação entre CTM-TAA de coelhos e hidroxiapatita de origem bovina foi capaz de promover uma maior regeneração óssea da calvária de coelhos. O uso de membrana colágena de origem porcina não foi capaz de promover maior regeneração óssea do que o uso células-tronco associadas ao enxerto xenógeno. / Introduction: The biomaterials commonly used in bone regeneration lack osteoinductive and osteogenic potential despite these biomaterials possess osteoconductive potential. Objective: To evaluate the association of adult mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (MSC-dAT) with xenogenic bone graft in bone regeneration in rabbit calvaria. Methods: MSCdAT from 12 animals were combined with hydroxyapatite and implanted in 12 mm bilateral bone defects created in the calvaria of six rabbits (experimental group - EG), whereas only hydroxyapatite was implanted in the defects created in another group of six animals (control group - CG). One of the grafted sides in each animal of both groups was covered by a collagen membrane. After eight weeks, the animals were sacrificed and the region of the bone defects was removed and evaluated by histomorphometry and immunohistochemistry. Results: Histomorphometrically, the EG showed higher amounts (p < 0.05) of vital and non-vital mineralized tissue (28.24% ± 6.17% and 27.79% ± 2.72%, respectively), compared to the CG (13.06% ± 5.24% and 13.52% ± 3.00%, respectively). In EG, no difference was observed (p > 0.05) in the amount of mineralized tissue between the side that was covered by the membrane versus the side without membrane coverage. On the other hand, a statistically significant difference (p < 0.05) was observed in the control group with regard to the amount of mineralized tissue between the sides with and without membrane coverage. Conclusions: These observations suggest that the association of MSC-dAT with a xenogenic bone graft was capable of promoting better bone regeneration compared to use of a xenograft alone. Use of a membrane did not produce an increase in the regenerative potential for the EG, in contrast to the CG.

Submitted by Karin Goebel (karing@fiocruz.br) on 2014-11-25T18:05:56Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruna Hilzendeger Marcon.pdf: 6455497 bytes, checksum: 8ea632ce91cdf16edd8b86a624972dba (MD5) / Approved for entry into archive by Karin Goebel (karing@fiocruz.br) on 2014-11-25T18:06:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruna Hilzendeger Marcon.pdf: 6455497 bytes, checksum: 8ea632ce91cdf16edd8b86a624972dba (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T18:06:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Bruna Hilzendeger Marcon.pdf: 6455497 bytes, checksum: 8ea632ce91cdf16edd8b86a624972dba (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil / As células-tronco (CTs) caracterizam-se por possuírem a capacidade de se autorrenovar e de dar origem a um ou mais tipos celulares diferenciados. Nos últimos anos, diversos trabalhos mostraram a existência de CTs em tecidos adultos, tornando-as uma alternativa interessante para uso em terapias celulares. Contudo, para melhor utilizar as CTs, é preciso primeiramente compreender como ocorre a diferenciação em um tipo celular específico e, principalmente, como é regulada a expressão gênica durante este processo. Em 2009, Ingolia e colaboradores apresentaram uma nova técnica conhecida como ribosome profiling, a qual consiste no isolamento e sequenciamento em larga escala dos fragmentos de RNA associados e protegidos pelos ribossomos, os quais têm um tamanho aproximado de 30 nucleotídeos (conhecido com footprint ribossomal). Ao mapear as sequências obtidas, é possível obter informações não apenas sobre quais sequências estão sendo traduzidas, mas também sobre a cinética da tradução e sua extensiva rede de regulação. Assim, o objetivo deste trabalho foi aplicar a técnica de ribosome profiling ao estudo do processo de diferenciação de CTs adultas. Como modelo de estudo, foram utilizadas CTs obtidas de tecido adiposo antes (t=0) e após a indução para diferenciação adipogênica por 3 dias (t=72h). O primeiro passo do trabalho foi a adaptação do protocolo de ribosome profiling para o estudo de CTs adultas, o qual consiste na lise celular, digestão do lisado com uma RNA nuclease (a qual irá degradar o RNA exposto, preservando os fragmentos protegidos pelo ribossomo), ultracentifrugação do homogenato sobre colchão de sacarose 1 M para sedimentação dos ribossomos, extração de RNA e isolamento dos fragmentos de 30 nucleotídeos. Também foi feita extração do RNA poliA. As amostras foram sequenciadas (SOLiD™) e os dados obtidos foram triados e mapeados contra um banco de dados de RNAm, utilizando-se a ferramenta CLC Genomics Workbench. Foram identificados mais de 8.000 transcritos para as amostras de ribosome profiling e mais de 17.000 para as de poliA. Ao calcular o fold change entre as condições t=0 e t=72h, foi possível verificar que mais de 50% dos genes foram detectados como diferencialmente expressos apenas por ribosome profiling. Observou-se que genes relacionados com vias de diferenciação adipogênica e de metabolismo de lipídeos encontravam-se regulados positivamente em ambas as amostras de RNA. Por outro lado, observou-se que vias de regulação do citoesqueleto de actina e de adesão focal estavam reguladas negativamente apenas nas amostras de ribosome profiling. Isso é interessante, uma vez que a inibição destas vias já foi descrita como importante para o processo de adipogênese. Além disso, foi observada uma forte redução na eficiência de tradução de genes relacionados com a tradução após 72 horas de indução para diferenciação. Os resultados obtidos no presente trabalho reforçam as evidências de que os mecanismos de regulação pós-transcricionais e traducionais têm um papel muito importante na regulação da diferenciação celular de CTs, sendo que a técnica de ribosome profiling permitiu obter informações mais detalhadas de como este processo pode estar acontecendo. / Stem cells (SC) are characterized by their capacity of both self-renewing and giving rise to new differentiated cells. SC are found in adult tissues, which are considered a putative source for cell therapy. However, little is known about the mechanisms involved in the trigger of SCs differentiation into a specific cell type. Understanding adult SCs differentiation process is a fundamental step to better use and to take advantage of their potential. In 2009, Ingolia and collaborators presented a new methodology of transcriptome analysis named ribosome profiling, which consists on the isolation and deep-sequencing of the mRNA fragments enclosed by ribosomes. When lysed cells are submitted to nuclease digestion, unprotected mRNA is degraded, while fragments within ribosomes are preserved and have a known footprint of 30 nucleotides. Sequencing these ribosome-protected fragments results in a high-precision measurement of in vivo translation, providing precise information about translation kinetics and its extensive regulation. The objective of this work was to apply the ribosome profiling methodology to the study of adipogenic differentiation in adult SCs. SCs were isolated from human adipose tissue from three donors and were cultured in a control medium (t=0) and induced to adipogenic differentiation for 72 hours (t=72h). The first step was to adapt and optimize the ribosome profiling protocol to the SC model, which consists in cell lysis, cell lysate digestion by nuclease (to degrade unprotected RNA, preserving ribosome-protected fragments), ultracentrifugation over a 1M sucrose cushion to pellet ribosomes, RNA extraction and 30 nucleotides fragments isolation. poliA RNA was also isolated. Samples were submitted to deep-sequencing (SOLiD™) and the reads obtained were trimmed and mapped onto the reference mRNA database using the CLC Genomics Workbench. Over 8000 transcripts were identified in ribosome profiling samples and over 17000 in poliA samples. Fold change analysis between t=0 and t=72h of both RNA samples showed that differential expression of more than 50% of the genes was identified only by ribosome profiling. Pathways related to adipogenesis and lipid metabolism were upregulated in both RNA samples. However, regulation of the actin cytoskeleton and focal adhesion proteins were downregulated only in ribosome profiling samples. Interestingly, downregulation of these pathways was already described as an important phenomenon to cell adipogenesis. Besides, we observed a strong reduction of translational efficiency of genes involved in translation at t=72h. Our results reinforce previous data, suggesting that posttranscriptional and translational regulation play a fundamental role in the regulation of SC differentiation process and that ribosome profiling is an important tool to better understand this process.

Introdução. O transplante de células é possibilidade terapêutica promissora para muitas doenças neurológicas. Nos últimos anos, a possibilidade do isolamento de células-tronco dos tecidos adultos, por exemplo da medula-óssea, atrai a atenção da comunidade científica, estratégia que minimiza os problemas éticos relativos ao uso de tecido fetal para implantes visando ao tratamento de doenças neurológicas. Entretanto, a eficiência da transdiferenciação de células-tronco mesenquimais em neurônios, bem como os mecanismos envolvidos nesse processo, permanecem desconhecidos. A obtenção de neurônios maduros ocorreu somente em sistemas de co-cultura, o que induz a questão se a diferenciação representa um potencial das células per si, ou se é possível somente devido à fusão com neurônios maduros. Objetivos. No presente trabalho, pretendeu-se verificar o potencial de as células-tronco mesenquimais tornarem-se neurônios e esclarecer os possíveis mecanismos envolvidos nesse processo. Material e métodos. Células-tronco mesenquimais foram isoladas de 20 doadores voluntários normais e caracterizadas por análise de separação celular ativada por fluorescência. A multipotencialidade foi investigada ao se diferenciar as células em condrócitos e osteócitos. A capacidade de auto-renovação foi confirmada pelo ensaio de incorporação de BrdU. Ulteriormente, as células foram diferenciadas por uma semana em meio contendo AMPc, IBMX, ou combinação de ambos, e os resultados foram comparados com o cultivo em meio básico. Diferentes bloqueadores de Ca2+ ou inibidores de PKA foram usados como tentativa de se impedir a diferenciação, ocorrência que foi mensurada com imunocitoquímica para NF-200 (marcador de neurônios maduros). O registro eletrofisiológico por meio de patch clamp foi usado para se confirmar o fenótipo neuronal. As figuras foram configuradas em microscopia confocal. Para análise estatística foi utilizada ANOVA com teste post-hoc. Resultados. As células isoladas expressaram CD90, 105, 44 e 13 mas foram negativas para CD34 e 45. Isto significa que não são de origem hematopoiética; 98,74 ± 0,43% das células incorporaram BrdU em 24 horas. Após o isolamento, foi possível diferenciá-las em condrócitos ou osteócitos. Em situação controle, não foram evidenciadas células positivas para NF200. Por outro lado, ocorreu positividade em 10,75% ± 1,35 (p<0,0001) das células sob IBMX e, em 15,18% ± 1,12, sob a combinação cAMP e IBMX (p<0,0001). Foram registradas correntes de Na+ e K+ dependentes de voltagem, mas não potenciais de ação. A diferenciação foi inibida com PKAi (5,73% ± 0,42, p<0,0001), nifedipina (5,79% ± 0,98, p<0,0001), Ni2+ (7,06% ± 1,68, p<0,0001) e Cd2+ (0 ± 0, p<0,0001). Discussão. Isolou-se uma população de células-tronco estromais da medula-óssea de seres humanos que se mostrou multipotencial e auto-renovável. O aumento da concentração de AMPc no meio elevou a concentração de neurônios para 15%. A diferenciação parece depender da via PKA mas também envolve a concentração intracelular de Ca2+. Conclusão. O correto entendimento de como as células-tronco mesenquimais diferenciam-se pode contribuir para aumentar a eficácia do método e, talvez um dia, tornar possível o uso dessa ferramenta no campo clínico. / Introduction. Cell transplantation has been considered a promising therapeutic approach for many neurological diseases. The possibility of isolation of stem cells from adult tissues, i.e. bone marrow, has attracted the attention of the scientific community in the recent years. This strategy is interesting on avoiding the ethical issues regarding the use of fetal tissue for neural implants. Moreover, the efficiency of the transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into neurons, and the mechanisms involved in this process remain largely unknown. The obtention of mature neurons was described only in coculture systems, what raised the question if the differentiation is a potential of the cells itself, or if it is possible only due to fusion with mature neurons. Objectives. In the present investigation, we aimed to verify the potential of MSCs to differentiate into neurons, and also to clarify the possible mechanisms involved on it. Material and methods. MSCs were isolated from 20 healthy human subjects and characterized by FACS-analysis. Multipotentiality was addressed by differentiating them into chondrocytes and osteocytes. The self-renewal capacity was confirmed with BrdU-incorporation assay. Afterwards, cells were differentiated for 1 week in a medium containing cAMP, IBMX, or a combination of both, and the results were compared with cells treated in basal-medium condition. Different Ca2+-blockers and PKA-inhibitor peptide were used on an attempt to impair differentiation, which was quantified with NF-200 immunostaining (a marker of mature neurons). Patch-clamp recording was used to confirm neuronal phenotype. Pictures were taken in confocal microscope. For statistical analysis ANOVA with a post-hoc test was used. Results. The isolated cells expressed CD90, 105, 44, and 13, but were negative for CD34 and 45, meaning that they were non-hematopoiethic; 98.74 ± 0.43 % of them incorporated BrdU in 6hs. After isolation, they differentiated into chondrocytes and osteocytes. In a control situation, no NF200 positive cell was seen. On the other hand, 10.75% ± 1.35 (p<.0001) of positivity was seen under IBMX and 15.18% ± 1.12 in the combination of cAMP with IBMX (p<.0001). Na+ and K+-voltage gated currents were recorded. Differentiation was impaired with PKAi (5.73% ± 0.42, p<.0001), nifedipin (5.79% ± 0.98, p<.0001), Ni2+ (7.06% ± 1.68, p<.0001), and Cd2+ (0 ± 0, p<.0001). Discussion. We were able to isolate a population of stromal stem cells from the bone marrow of human subjects, since they were multipotential and self-renewable. Increasing the concentration of cAMP raised the percentage of neurons up to 15%. The differentiation seems to be dependent on the PKA pathway, but also involved the intracellular concentration of Ca2+. Conclusions. The complete understanding of how MSC differentiate can contribute to increase the efficiency of the method and thus make possible to use this powerful tool in the clinical practice.

Células-tronco adultas podem ser isoladas de vários tecidos, dentre eles a polpa dentária humana, tecido originado na papila dentária do dente em desenvolvimento. Estas linhagens multipotentes podem ser estudadas sob vários aspectos, como na elucidação da histogênese de tumores. O objetivo deste estudo foi inferir a histogênese do mixoma odontogênico, neoplasia odontogênica benigna, analisando a expressão de proteínas da matriz extracelular (MEC) e de metaloproteinases da matriz (MMPs) em células-tronco adultas de polpa dentária humana. Três linhagens diferentes de células-tronco originadas de polpas dentárias humanas IDPSCs (DL-1, DL-2 e DL4) foram utilizadas. As proteínas analisadas foram as mesmas expressas na neoplasia: vimentina, colágeno tipo I, fibronectina, tenascina, ácido hialurônico e MMPs (MMP-1, MMP-2 e MMP-9). Imunofluorescência e ensaios enzimáticos foram utilizados para analisar a presença de proteínas nas células cultivadas e no meio de cultura condicionado por estas células, respectivamente. Todas as linhagens celulares expressaram a vimentina e nenhuma expressou o ácido hialurônico. A linhagem celular DL-1 expressou todas as outras proteínas da matriz extracelular estudadas, enquanto que na linhagem DL-2 apenas não foi observada a expressão do colágeno tipo I. Fibronectina e tenascina não foram observados na linhagem DL-4. Todas as linhagens expressaram todas as MMPs, sendo que a produção de MMP-2 nas três linhagens foi significantemente maior que a de todas outras MMPs. Baseado nas condições deste estudo, é possível concluir que a expressão de proteínas da MEC e de MMPs em células-tronco de polpa dentária humana apresentaram perfil similar àquela apresentada no mixoma odontogênico, exceto pela ausência de marcação do ácido hialurônico em todas as linhagens. A ausência de secreção de ácido hialurônico pelas IDPSCs poderia indicar que o mixoma odontogênico deriva de uma célula mais diferenciada que as células-tronco. / Adult stem cells can be isolated from different tissues including the human dental pulp, a structure originated from the dental papillae. These cell lineages are of importance in a series of studies, as the analysis of tumors histogenesis. The aim of this study was to infer the histogenesis of odontogenic myxoma, a benign odontogenic neoplasia by analyzing the ECM and MMPs molecules expressed in human dental pulp stem cells. Three different lineages of immature dental pulp stem cells (IDPSCs) (DL-1, DL-2 and DL-4) were used. The proteins searched were those expressed by the tumoral cells: vimentin, type I collagen, fibronectin, tenascin and hialuronic acid (HA) and the matrix metalloproteinases (MMP-1, MMP-2 and MMP-9). Immunofluorecence and enzymatic assays were used for analyzing the presence of the proteins in the cells and in the culture media conditioned by the cells, respectively. All the lineages expressed vimentin; however none expressed HA. DL-1 lineage expressed all the other ECM proteins, and the expression of type I collagen was not observed in the DL-2 lineage. Fibronectin and tenascin were not observed in the DL-4 lineage. All the lineages expressed all the MMPs. The release of MMP-2 from all cell lineages was significantly higher than those of all other MMPs. Based on the conditions of this study its possible to conclude that the overall expression of MEC proteins and MMPs in the lineages of human dental pulp stem cells were similar to those found in the odontogenic myxoma, except for the absence of hyaluronic acid. The absence of HA secretion by the IDPSCs could indicate that the odontogenic myxoma tumoural cells derive from a cell more differentiated than the stem cells.

INTRODUÇÃO: As células-tronco mesenquimais (CTM) são células adultas multipotentes capazes de se diferenciarem em várias linhagens celulares. Estudos com CTM derivadas do cordão umbilical humano (CUh), mais especificamente da Geleia de Wharton (GW), tem demonstrado um grande potencial para a terapia de reposição celular e regeneração tecidual. O papel dos genes de resistência a múltiplas (MDR) drogas, tais como ABCB1 e LRP é bem conhecido nos processos de regulação, fisiologia e defesa. Entretanto, nenhum estudo demonstrou ainda a presença desses genes nas CTM da GW do CUh. Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar a expressão de Pg-p e LRP em CTM derivadas da GW. MATERIAIS E MÉTODOS: CTMs da GW isoladas de CUh (n = 20) foram caracterizadas quanto ao seu estado indiferenciado por: citometria de fluxo; expressão de genes Oct-4 e Nanog por RT-PCR e capacidade de diferenciação adipogênica e osteogênica in vitro. Foi analisado ainda a expressão dos genes ABCB1 e LRP por RT-PCR em tempo real de células indiferenciadas. A resistência a doxorrubicina (DOX) foi determinada através do ensaio de MTT nessas mesmas amostras. RESULTADOS: As CTM da GW do CUh apresentaram positividade para marcadores de superfície presentes nas CTM, tais como, CD29, CD44, CD90 e CD105. Os genes de indiferenciação celular Oct-4 e Nanog foram expressos em todas as amostras, que também foram capazes de se diferenciar em adipócitos e osteócitos, comprovando assim que essas células são CTM. Com relação à Pg-p, o gene ABCB1 não amplificou em 18 amostras sendo que somente 2 apresentaram baixa expressão gênica. O gene LRP amplificou de forma intensa em todas as amostras analisadas. CONCLUSÃO: Concluímos que as CTM derivadas da GW do CUh apresentam um elevado nível de expressão de LRP, sugerindo que este gene pode estar envolvido no processo de regulação das células-tronco mesenquimais, bem como na fisiologia e defesa celular / INTRODUCTION: Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent adult cells that can differentiate into various cell lineages. Studies with MSC derived from human umbilical cord (hUC), more specifically from Wharton jelly (WJ), have shown great potential for cellular replacement therapy and tissue regeneration. The role of multidrug resistance genes, such as ABCB1 and LRP is well known in the regulation, physiology and cellular defense. However, the presence of these genes in the MSC of the WJ from hUC was not demonstrated yet. The aim of this study was to analyze the expression of Pg-p and LRP in MSCs derived from WJ. MATERIALS AND METHODS: The MSC from WJ were isolated from hUC (n = 20) and were characterized by: flow cytometry; Oct-4 and Nanog gene expression by RT-PCR and adipogenic and osteogenic in vitro differentiation capability of these cells. It was also analyzed gene expression of ABCB1 and LRP by real time RT-PCR of undifferentiated cells. Doxorubicin (DOX) resistance was determined by MTT assay in all the samples. RESULTS: MSC WJ from hUC was positive for MSC surface markers, such as CD29, CD44, CD90 and CD105. The undifferentiated cell genes Oct-4 and Nanog were expressed in all samples, which were also capable to differentiate into adipocytes and osteocytes, proving that these cells are MSC. Concerning to Pgp, the ABCB1 gene, 18 samples didn\'t show any amplification product (no expression) while 2 showed little gene expression. The LRP gene amplified intensely in all samples. CONCLUSION: We conclude that MSC derived from the WJ hUC have a high level of LRP expression, suggesting that this gene may be involved in the regulation of mesenchymal stem cells as well as in physiology and cellular defense