Orientador: Tereza Cristina Cardoso / Co-orientador: Maria Cecília Rui Luvizotto / Banca: Rafael Silva Cipriano / Banca: Vera Lúcia Lorenzetti Magalhaes Curci / Banca: Carlos Noriyki Kaneto / Banca: Cáris Maroni Nunes / Resumo:A infecção pelo herpesvírus Bovino tipo 5 (BoHV-5) resulta em meningoencefalite não supurativa que é responsável por perdas econômicas significativas na América do Sul. Células tronco mesenquimais (CTM) são encontradas em diferentes tecidos fetais, como no cordão umbilical que possuí diversos fatores favoráveis para obtenção destas células. O objetivo da presente pesquisa foi avaliar o isolamento e a viabilidade das CTM bovinas e sua capacidade de diferenciação em outros tecidos de origem mesenquimal, como as "neuron-like cells" - células semelhantes a neurônios - (CSN), e avaliar a possibilidade da utilização das mesmas como modelo de infecção experimental com BoHV-5. As CTM foram isoladas da geleia de Wharton e diferenciadas em tecido adiposo, cartilagem, ósseo e CSN. As linhagens celulares foram caracterizadas pela expressão genica e imunofenotipicamente, utilizando a técnica de PCR, imunocitoquímica e citometria de fluxo, respectivamente. O conjunto de primers e painel de anticorpos primários, empregados na experimentação, permitiu caracterizar as células tronco e sua diferenciação em células neuronais. Após a adaptação e diferenciação, ambas as células foram infectadas pelo BoHV-5, exibindo efeito citopático e taxa de replicação viral aumentada 72 h pós infecção. A técnica de hibridização in situ identificou as partículas virais no interior das CSN e no meio extracelular. Os resultados demonstram a capacidade de diferenciação das CTM em outros tipos celulares e a possibilidade da utilização das mesmas como modelo de infecção in vitro de células neuronais pelo BoHV-5. Estes resultados corroboram o uso de MSC como fonte de NLC para uso no estudo da patogênese da infecção experimental pelo BoHV-5 / Abstract:Bovine Herpesvirus type 5 (BoHV-5) infection results in non- suppurative meningoencephalitis which underlies significant economic losses in South America. Mesenchymal stem cells (MSCs) are found in fetal tissues, such as the umbilical cord. The goal of this research was to characterize the isolation and viability of bovine umbilical cord MSCs for in vitro differentiation into "neuron-like cells" (NLC) to be used as a model for experimental infection with BoHV-5. MSCs were isolated from Wharton's jelly and differentiated in vitro into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic cells as well as NLC. The cells lines were characterized molecularly and immunophenotypically, using PCR, immunocytochemistry, and flow cytometry. The set of primers and panel of primary antibody used in the experiments confirmed the isolation of mesenchymal stem cells and their differentiation into neuronal-like cells. After adaptation and differentiation, the cells were infected with BoHV-5, exhibiting typical cytopathic effect and increased viral replication rate 72 h post-infection. Viral particles were identified in the NLC and in the extracellular environment. by in situ hybridization These results corroborate the use of MSCs as a source of NLC which can be used to study the pathogenesis of the experimental in vitro infection wtih BoHV-5 / Doutor

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Coorientador: Bruna De Vita / Banca: Leandro Maia / Banca: Cláudia Barbosa Fernandes / Resumo: As células tronco mesenquimais (CTMs) estão presentes na maioria dos tecidos adultos e possuem grande capacidade de multiplicação, o que as tornam muito atrativas para a terapia celular, tanto na medicina humana como na medicina veterinária . Quando cultivadas in vitro são capazes de se auto renovar e dar origem a novos tipos celulares. Atualmente há uma grande tendência para a utilização de CTMs obtidas de tecidos fetais, como a membrana amniótica (MA), matriz extravascular do cordão umbilical (CU) e sangue do cordão umbilical (SCU), podendo ser obtidas no momento do parto por uma técnica não invasiva. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar, diferenciar e criopreservar CTMs obtidas de MA, CU e SCU de fetos bovinos colhidos no momento do parto e em abatedouro. As células foram recuperadas por meio de digestão enzimática tecidual, realizada com solução de colagenase 0,1%. Foram colhidas amostras de MA e CU no momento do parto (n=6) e de MA e CU no terço inicial de gestação (n=6), bem como de SCU no terço médio de gestação em abatedouro (n=6), as quais foram submetidas às análises morfológica, imunocitoquímica, imunofenotípica por citometria de fluxo e diferenciações in vitro nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica e criopreservação. Além disso, foram criopreservadas e analisadas por citometria de fluxo para observação da viabilidade celular. Todas as amostras dos diferentes períodos gestacionais demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico todas as amostras foram imunomarcadas para CD44, NANOG e Oct-4, com ausência de marcação para MHC II. Na análise imunofenotipica por citometria de fluxo, todas as amostras apresentaram marcação para CD44, ausência de marcação para CD34 e baixa expressão de MHC II. Apresentaram também capacidade de diferenciação in vitro nas três linhagens mesodermais e quando analisadas ... / Abstract: Stem cells are undifferentiated cells with a high proliferation potential. These cells can be characterized by their in vivo ability to self-renew and to differentiate into specialized cell lines. The most used stem cell type, in both human and veterinary field, is the mesenchymal stem cells (MSC). Nowadays, there is a great tendency to use stem cells derived from fetal tissues, such as amniotic membrane (AM), extravascular matrix of umbilical cord (EMUC) and umbilical cord blood (UCB), which can be obtained non-invasively at delivery time. Thus, the aim of this study was to isolate, characterize and differentiate. MSC derived from bovine fetal annexes cow dairy neonates after assisted delivery and of fetus obtained in slaughterhouse. Cells were isolated by enzymatic digestion of the tissue fragments with 0,1% collagenase solution. Six samples of AM and EMUC at delivery time, six samples of AM and EMUC at first third of pregnancy and six samples of UCB at secondary third of pregnancy were subjected to morphology evaluation, immunocytochemistry, flow cytometry and in vitro osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation. Moreover, sample were cryopresrved and evaluated for viability by flow citometri. All samples showed adherence to plastic and fibroblast-like morphology. Immunocytochemistry revealed expression of CD 44, NANOG and OCT-4 and lack of expression of MHC II in MSC from all samples. Flow cytometry demonstrated that cells from all samples expressed CD 44, lacked CD 34 expression and showed low expression of MHC II. They were also capable of trilineage mesenchymal differentiation and showed 80-90% viability after cryopreservation. According to the results, AM, EMUC and UCB, either obtained at delivery time or from slaughterhouse, are a painless and non-invasive source of MSC and can be used for stem cell bank creation / Mestre

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-27Bitstream added on 2015-04-09T12:48:04Z : No. of bitstreams: 1 000814098.pdf: 1490588 bytes, checksum: ac5274fb5b2345e0c2260a454c1dfdd0 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Bovine Herpesvirus type 5 (BoHV-5) infection results in non- suppurative meningoencephalitis which underlies significant economic losses in South America. Mesenchymal stem cells (MSCs) are found in fetal tissues, such as the umbilical cord. The goal of this research was to characterize the isolation and viability of bovine umbilical cord MSCs for in vitro differentiation into neuron-like cells (NLC) to be used as a model for experimental infection with BoHV-5. MSCs were isolated from Wharton's jelly and differentiated in vitro into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic cells as well as NLC. The cells lines were characterized molecularly and immunophenotypically, using PCR, immunocytochemistry, and flow cytometry. The set of primers and panel of primary antibody used in the experiments confirmed the isolation of mesenchymal stem cells and their differentiation into neuronal-like cells. After adaptation and differentiation, the cells were infected with BoHV-5, exhibiting typical cytopathic effect and increased viral replication rate 72 h post-infection. Viral particles were identified in the NLC and in the extracellular environment. by in situ hybridization These results corroborate the use of MSCs as a source of NLC which can be used to study the pathogenesis of the experimental in vitro infection wtih BoHV-5 / FAPESP: 2010/50626-5

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-10. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:21Z : No. of bitstreams: 1 000831319.pdf: 1267209 bytes, checksum: c23ca8ee7c298aed36bdf625fb1e71a9 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As células tronco mesenquimais (CTMs) estão presentes na maioria dos tecidos adultos e possuem grande capacidade de multiplicação, o que as tornam muito atrativas para a terapia celular, tanto na medicina humana como na medicina veterinária . Quando cultivadas in vitro são capazes de se auto renovar e dar origem a novos tipos celulares. Atualmente há uma grande tendência para a utilização de CTMs obtidas de tecidos fetais, como a membrana amniótica (MA), matriz extravascular do cordão umbilical (CU) e sangue do cordão umbilical (SCU), podendo ser obtidas no momento do parto por uma técnica não invasiva. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar, diferenciar e criopreservar CTMs obtidas de MA, CU e SCU de fetos bovinos colhidos no momento do parto e em abatedouro. As células foram recuperadas por meio de digestão enzimática tecidual, realizada com solução de colagenase 0,1%. Foram colhidas amostras de MA e CU no momento do parto (n=6) e de MA e CU no terço inicial de gestação (n=6), bem como de SCU no terço médio de gestação em abatedouro (n=6), as quais foram submetidas às análises morfológica, imunocitoquímica, imunofenotípica por citometria de fluxo e diferenciações in vitro nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica e criopreservação. Além disso, foram criopreservadas e analisadas por citometria de fluxo para observação da viabilidade celular. Todas as amostras dos diferentes períodos gestacionais demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico todas as amostras foram imunomarcadas para CD44, NANOG e Oct-4, com ausência de marcação para MHC II. Na análise imunofenotipica por citometria de fluxo, todas as amostras apresentaram marcação para CD44, ausência de marcação para CD34 e baixa expressão de MHC II. Apresentaram também capacidade de diferenciação in vitro nas três linhagens mesodermais e quando analisadas ... / Stem cells are undifferentiated cells with a high proliferation potential. These cells can be characterized by their in vivo ability to self-renew and to differentiate into specialized cell lines. The most used stem cell type, in both human and veterinary field, is the mesenchymal stem cells (MSC). Nowadays, there is a great tendency to use stem cells derived from fetal tissues, such as amniotic membrane (AM), extravascular matrix of umbilical cord (EMUC) and umbilical cord blood (UCB), which can be obtained non-invasively at delivery time. Thus, the aim of this study was to isolate, characterize and differentiate. MSC derived from bovine fetal annexes cow dairy neonates after assisted delivery and of fetus obtained in slaughterhouse. Cells were isolated by enzymatic digestion of the tissue fragments with 0,1% collagenase solution. Six samples of AM and EMUC at delivery time, six samples of AM and EMUC at first third of pregnancy and six samples of UCB at secondary third of pregnancy were subjected to morphology evaluation, immunocytochemistry, flow cytometry and in vitro osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation. Moreover, sample were cryopresrved and evaluated for viability by flow citometri. All samples showed adherence to plastic and fibroblast-like morphology. Immunocytochemistry revealed expression of CD 44, NANOG and OCT-4 and lack of expression of MHC II in MSC from all samples. Flow cytometry demonstrated that cells from all samples expressed CD 44, lacked CD 34 expression and showed low expression of MHC II. They were also capable of trilineage mesenchymal differentiation and showed 80-90% viability after cryopreservation. According to the results, AM, EMUC and UCB, either obtained at delivery time or from slaughterhouse, are a painless and non-invasive source of MSC and can be used for stem cell bank creation

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-10Bitstream added on 2015-01-26T13:30:37Z : No. of bitstreams: 1 000793044_20160731.pdf: 99971 bytes, checksum: 8ad7de8362aa1813828c219bcb43b617 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-01T11:29:57Z: 000793044_20160731.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-01T11:30:55Z : No. of bitstreams: 1 000793044.pdf: 846665 bytes, checksum: 7b1e08d3b9f1e489fd31f5d654c44a76 (MD5) / As células tronco mesenquimais (CTMs) estão presentes na maioria dos tecidos adultos, e por isso são atrativas para a terapia celular, pois possuem alto potencial de diferenciação e proliferação, sendo assim, utilizadas na reconstrução tecidual. O presente experimento objetivou obter maior conhecimento sobre CTMs derivadas da membrana amniótica e cordão umbilical de cães, antes e após criopreservação, visando a formação de um banco de células. Assim, oito amostras de membrana amniótica e oito amostras de gelatina de Wharton foram obtidas de cesarianas, as quais foram submetidas a digestão enzimática, e cultivadas em meio basal. Uma porção celular, de cada amostra, foi criopreservada em 1ª passagem, de forma lenta, e armazenada por 4 semanas. As células antes e após a criopreservação foram submetidas à caracterização, onde foi observado características de adesão, proliferação, diferenciação e expressão de marcadores de superfícies utilizando-se citometria de fluxo, e imunocitoquímica. A partir destas avaliações, foi possível demonstrar que as células antes e após a criopreservação exibiram comportamento semelhante, quanto à proliferação e crescimento. A viabilidade celular da membrana amniótica apresentou 97,0% das células viáveis antes da criopreservação e 94,6% após, já a gelatina de Wharton 98,8 antes e 93,5% após a criopreservação. O potencial de diferenciação nas linhagens osteogênica e adipogênica foi mantido, no entanto foi necessário um tempo maior (p<0,05) para que as células de gelatina de Wharton se diferenciassem após a criopreservação. E ainda mantiveram a expressão de CD44, em níveis satisfatórios para que fossem consideradas positivas, onde a membrana amniótica expressou 85,6% antes e 67,8% após a criopreservação e a gelatina de Wharton expressou 86,0% antes e 82,1% após a criopreservação e a ausência de expressão ... / Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in most of adult tissues, and are therefore attractive for cell therapy. Because of their high potential for differentiation and proliferation, they are being used in tissue reconstruction. This experiment aimed to enrich knowledge of canine MSCs derived from umbilical cord and amniotic membrane before and after cryopreservation regarding the formation of a cell bank. Thus, eight samples of amniotic membrane and eight samples of Wharton’s jelly were obtained from dogs at birth, which were subjected to enzymatic digestion and basal medium culture. Slow freezing of a sample from each culture was held at the first passage and stored for four weeks. Before and after freezing cells were subjected to characterization being observed adhesion, proliferation, differentiation and expression of surfaces markers using flow cytometry and immunocytochemistry. Based on these analyses it was demonstrated that the cells before and after cryopreservation exhibited similar behavior for proliferation and cell growth. Cell viability of amniotic membrane showed 97.0% of viable cells before freezing and 94.6% after, and the Wharton’s jelly 98.8% before and 93.5% after cryopreservation. The potential of the osteogenic and adipogênica differentiation as well as maintained, however it required a longer time (p <0.05) for the cells from Wharton's jelly to differentiate themselves after freezing. And still maintained the expression of CD44, at satisfactory levels to be considered positive, where the amniotic membrane expressed 85.6% before and 67.8% after freezing and Wharton’s Jelly expressed 86.0% before and 82.1% after cryopreservation and absence of expression of CD34 and MHC II. A peculiar feature observed was that before and after freezing spontaneous differentiation in both lineages (osteogenic and adipogenic) occurred in the controls that were not induced to differentiation. We conclude that ...

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Banca: Maria Denise Lopes / Banca: Carlos Eduardo Ambrósio / Resumo: As células tronco mesenquimais (CTMs) estão presentes na maioria dos tecidos adultos, e por isso são atrativas para a terapia celular, pois possuem alto potencial de diferenciação e proliferação, sendo assim, utilizadas na reconstrução tecidual. O presente experimento objetivou obter maior conhecimento sobre CTMs derivadas da membrana amniótica e cordão umbilical de cães, antes e após criopreservação, visando a formação de um banco de células. Assim, oito amostras de membrana amniótica e oito amostras de gelatina de Wharton foram obtidas de cesarianas, as quais foram submetidas a digestão enzimática, e cultivadas em meio basal. Uma porção celular, de cada amostra, foi criopreservada em 1ª passagem, de forma lenta, e armazenada por 4 semanas. As células antes e após a criopreservação foram submetidas à caracterização, onde foi observado características de adesão, proliferação, diferenciação e expressão de marcadores de superfícies utilizando-se citometria de fluxo, e imunocitoquímica. A partir destas avaliações, foi possível demonstrar que as células antes e após a criopreservação exibiram comportamento semelhante, quanto à proliferação e crescimento. A viabilidade celular da membrana amniótica apresentou 97,0% das células viáveis antes da criopreservação e 94,6% após, já a gelatina de Wharton 98,8 antes e 93,5% após a criopreservação. O potencial de diferenciação nas linhagens osteogênica e adipogênica foi mantido, no entanto foi necessário um tempo maior (p<0,05) para que as células de gelatina de Wharton se diferenciassem após a criopreservação. E ainda mantiveram a expressão de CD44, em níveis satisfatórios para que fossem consideradas positivas, onde a membrana amniótica expressou 85,6% antes e 67,8% após a criopreservação e a gelatina de Wharton expressou 86,0% antes e 82,1% após a criopreservação e a ausência de expressão ... / Abstract: Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in most of adult tissues, and are therefore attractive for cell therapy. Because of their high potential for differentiation and proliferation, they are being used in tissue reconstruction. This experiment aimed to enrich knowledge of canine MSCs derived from umbilical cord and amniotic membrane before and after cryopreservation regarding the formation of a cell bank. Thus, eight samples of amniotic membrane and eight samples of Wharton's jelly were obtained from dogs at birth, which were subjected to enzymatic digestion and basal medium culture. Slow freezing of a sample from each culture was held at the first passage and stored for four weeks. Before and after freezing cells were subjected to characterization being observed adhesion, proliferation, differentiation and expression of surfaces markers using flow cytometry and immunocytochemistry. Based on these analyses it was demonstrated that the cells before and after cryopreservation exhibited similar behavior for proliferation and cell growth. Cell viability of amniotic membrane showed 97.0% of viable cells before freezing and 94.6% after, and the Wharton's jelly 98.8% before and 93.5% after cryopreservation. The potential of the osteogenic and adipogênica differentiation as well as maintained, however it required a longer time (p <0.05) for the cells from Wharton's jelly to differentiate themselves after freezing. And still maintained the expression of CD44, at satisfactory levels to be considered positive, where the amniotic membrane expressed 85.6% before and 67.8% after freezing and Wharton's Jelly expressed 86.0% before and 82.1% after cryopreservation and absence of expression of CD34 and MHC II. A peculiar feature observed was that before and after freezing spontaneous differentiation in both lineages (osteogenic and adipogenic) occurred in the controls that were not induced to differentiation. We conclude that ... / Mestre

INTRODUÇÃO: Células-tronco mesenquimais da geleia de Wharton (GW-CTM) exibem a capacidade de modular a resposta das células T e geralmente esses efeitos imunomoduladores são anti-inflamatórios. Devido ao seu potencial imunossupressor, as CTM emergiram recentemente como uma ferramenta promissora para terapia celular. No entanto, essas células têm uma vida útil limitada in vitro, com redução progressiva da sua capacidade de autorrenovação e parada irreversível do ciclo celular. O resultado deste processo é a perda da funcionalidade das CTM, o que limita a sua utilização para fins terapêuticos. Pouco se sabe sobre a variabilidade individual das amostras de GW-CTM e como isso poderia afetar sua expansão in vitro, seu potencial imunomodulador e o processo de envelhecimento. Neste estudo, avaliamos o perfil de citocinas imunomoduladoras e a capacidade das GW-CTM inibir a proliferação de células T durante o processo de senescência replicativa para determinar se a resposta esperada é afetada. MÉTODOS: GW-CTM foram cultivadas até a senescência replicativa ser atingida; as amostras foram coletadas numa fase inicial (passagem 5), numa etapa intermediária (passagem 15) e na senescência replicativa (passagem geralmente entre 20 e 25) para análise do perfil basal de moléculas imunomoduladoras. GW-CTM foram cocultivadas com amostras de duas células mononucleares de sangue periférico (PBMC), obtidas de doadores de plaquetas saudáveis. PBMC foi estimulado com fitohemaglutinina (PHA) durante 72 horas e cocultivado com três amostras de GW-CTM diferentes para medir a supressão da proliferação das células T. Os experimentos foram realizados utilizando as passagens P5 e P10. As análises foram feitas por PCR em tempo real, western blot e citometria de fluxo. RESULTADOS: Nossos resultados mostram que a expressão gênica e a secreção de moléculas imunomoduladoras variam entre amostras de GW-CTM, sem padrão específico. Em cocultura, todas as GW-CTM foram capazes de inibir a proliferação de células T CD3+ ativadas por mitogéno, embora em diferentes graus. E cada PBMC respondeu à cocultura com um nível diferente de inibição. Além disso, o perfil imunomodulador de todas as GW-CTM foi essencialmente mantido, mesmo após várias passagens. CONCLUSÃO: Nossos dados indicam que cada GW-CTM exibe um comportamento único, diferindo nos padrões de expressão e secreção de citocinas e capacidade imunomoduladora. Essa variabilidade intrínseca entre amostras pode influenciar a eficácia de GW-CTM quando utilizadas em terapia celular / INTRODUCTION: Wharton\'s jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSC) exhibit the ability to modulate T cell responses and these immunomodulatory effects are usually anti-inflammatory. Due to their immunosuppressive potential, MSC have recently emerged as a promising tool for cell therapy. However, MSC have a limited lifespan in vitro, with a progressive reduction in their capacity for selfrenewal leading to irreversible arrest of cell division. The result of this process is the loss of stem cell functionality, which limits its use for therapeutic purposes. Information on the variability of individual cell samples impacting upon in vitro expansion, immunomodulatory potential, and aging processes is still lacking. In this study, we evaluated the immunomodulatory cytokine profile and capacity to inhibit T cell proliferation of WJ-MSC progressing to replicative senescence to determine if the expected response is affected. METHODS: WJ-MSC were cultured until replicative senescence was reached and the samples were collected at an early stage (passage 5), at an intermediate stage (passage 15), and in replicative senescence (passage generally between 20 and 25) to analyze the basal profile of immunomodulatory molecules. WJ-MSC were co-cultured with samples from the same two peripheral blood mononuclear cells (PBMC), obtained from healthy platelet donors. PBMC were stimulated with phytohemagglutinin (PHA) for 72 hours and tested against 3 different WJ-MSC to measure suppression of T cell proliferation. The experiments were performed using passages P5 and P10. Analyses were done by real-time PCR, western blot, and flow cytometry. RESULTS: Our results show that gene expression and secretion of immunomodulatory molecules varied among WJ-MSC samples with no specific pattern discernible. In co-culture all WJ-MSC were capable of inhibiting mitogen-activated CD3+ T cell proliferation, although to different extents and each PBMC responded with its unique level of inhibition. In addition, the immunomodulatory profile of each WJ-MSC sample was essentially maintained even after several passages. CONCLUSION: Our results indicate that each WJMSC displays a unique behavior, differing in patterns of cytokine mRNA expression and immunomodulatory capacity. The intrinsic variability between samples may influence the effectiveness of WJ-MSC when employed therapeutically

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-12-04T21:15:20Z No. of bitstreams: 1 AngelicaFernandesGurgelDeSousa_DISSERT.pdf: 4154120 bytes, checksum: 9b7e3179ef04b1aafa2fdd770a6124d4 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-12-08T23:03:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AngelicaFernandesGurgelDeSousa_DISSERT.pdf: 4154120 bytes, checksum: 9b7e3179ef04b1aafa2fdd770a6124d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-08T23:03:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AngelicaFernandesGurgelDeSousa_DISSERT.pdf: 4154120 bytes, checksum: 9b7e3179ef04b1aafa2fdd770a6124d4 (MD5) Previous issue date: 2017-05-26 / Os problemas relacionados com defeitos ?sseos continuam a motivar a busca de terapias mais eficazes. Assim, a combina??o de biomateriais, c?lulas-tronco e mol?culas bioativas fazem parte das ferramentas usadas pela medicina regenerativa para alcan?ar esse objetivo. Diversos estudos j? mostraram o potencial osteog?nico dos polissacar?deos sulfatados (PSs) extra?dos de macroalgas marinhas. Entre eles, o fucoidan, isolado da alga marrom Fucus vesiculosus, ? o mais estudado, sendo j? comercializado por algumas empresas. As algas verdes tamb?m s?o fonte de PSs, mas estas s?o ainda pouco exploradas para aplica??es na regenera??o ?ssea. Em geral, as aplica??es cl?nicas dos PSs extra?dos de algas ainda s?o limitadas devido ? escassez de estudos sobre os seus efeitos, como por exemplo, o potencial genot?xico ? desconhecido na maioria dos casos. Assim, neste trabalho avaliamos a atividade osteog?nica 1) do Fucoidan de F. vesiculosus (um extrato comercializado pela Sigma), 2) das amostras ricas em PSs obtidas do subfracionamento do fucoidan comercial, e 3) do extrato rico em PSs extra?dos da alga verde Caulerpa sertularioides usando como modelo c?lulas-tronco humanas isoladas da geleia de Wharton de cord?es umbilicais (CTMH-GW). Estudou-se tamb?m o potencial genot?xico dos extratos totais de F. vesiculosus e C. sertularioides e posteriormente, da subfra??o do fucoidan que apresentou maior potencial osteog?nico, utilizando do ensaio de micron?cleo com bloqueio da citocinese (CBMN) na linhagem CHO-K1. Os ensaios de redu??o do MTT evidenciaram que as amostras ricas em PSs n?o apresentaram citotoxicidade significativa ao longo de 72 h, at? 10 ?g.mL-1. Os ensaios de atividade da fosfatase alcalina (ALP) e de mineraliza??o sugerem que as amostras ricas em PSs possuem atividades osteog?nicas diferentes: a subfra??o do fucoidan FUC 0.5 (5 ?g.mL-1) foi a que apresentou melhor resultado, aumentando 124% a atividade da ALP em rela??o ao controle positivo (c?lulas mantidas em meio osteog?nico). J? o extrato total de C. sertularioides (5 ?g.mL-1) aumentou 192% a atividade da ALP. Adicionalmente, todas as amostras testadas induziram o ac?mulo de c?lcio na matriz extracelular. Quanto ? genotoxicidade, os resultados do ensaio CBMN sugerem que, nas condi??es testadas, estas amostras n?o s?o genot?xicas, indicando que podem ser uma alternativa para terapias de regenera??o ?ssea. / Problems related with bone defects continue to motivate the search for more effective therapies. Thus, the combination of biomaterials, stem cells and bioactive molecules is part of the tools used by regenerative medicine to achieve this goal. Several studies have already shown the osteogenic potential of sulfated polysaccharides (SPs) extracted from marine macroalgae. Among them, fucoidan, isolated from brown algae Fucus vesiculosus, is the most studied, and is already commercialized by some companies. Green algae are also a source of SPs, but these are even more unexploited in the scope of bone regeneration. In general, the clinical applications of SPs from algae are very limited, because studies on their effects are scarce, for example, their genotoxic effects are unknown in most cases. Thus, in this work, we evaluated the osteogenic activity of Fucoidan from F. vesiculosus (an extract commercialized by Sigma), 2) SPs-rich samples obtained from subfractionation of commercial fucoidan, and 3) SPs-enriched extract from green algae Caulerpa Sertularioides, using human mesenchymal stem cells isolated from the Wharton jelly of umbilical cords (CTMH-GW) as cell model. It was also studied the genotoxic potential of the total extracts of F. vesiculosus and C. sertularioides, using the cytokinesis block micronucleus assay (CBMN) in the line CHO-K1. The genotoxicity of fucoidan?s subfraction that presented greater osteogenic potential was also evaluated. The MTT reduction assays showed that SPs-enriched samples did not show significant cytotoxicity over 72 h, up to 10 ?g.mL-1. Alkaline phosphatase (ALP) activity and mineralization assays suggest that SPs-enriched samples have different osteogenic activities: fucoidan subfraction FUC 0.5 (5 ?g.mL-1) showed the best result, increasing 124% the ALP activity in relation to the positive control (cells maintained in osteogenic medium). The total extract of C. sertularioides (5 ?g.mL-1) increased the ALP activity by 192%. In addition, all samples tested induced calcium accumulation in the extracellular matrix. Concerning to genotoxicity, CBMN assay results suggest that, under the tested conditions, these samples are not genotoxic, indicating their potential as alternative bone regeneration therapy.

Resumo:o presente trabalho teve por objetivo isolar células mesenquimais da geléia de Wharton do cordão umbilical canino e avaliar, in vitro, o efeito do plasma rico em plaquetas (PRP) e da matriz óssea desmineralizada (MOD) na diferenciação osteogênica destas células na ausência de meio osteoindutor. As células foram isoladas e caracterizadas como células mesenquimais indiferenciadas com fenótipo semelhante a de fibroblastos e fenótipo característico confirmado pela citometria de fluxo com CD44+, CD105+, CD271+, CD34- e CD45-; além da habilidade de diferenciação em adipócitos, condrócitos e osteócitos. Com exceção do grupo controle (células mesenquimais), em todos os grupos, G-PRP (células mesenquimais e PRP), G-MOD (células mesenquimais e MOD) e G-PRP+MOD (células mesenquimais e PRP + MOD), houve diferenciação osteoblástica com produção de matriz óssea mineralizada, confirmada pela coloração vermelho de Alizarina. A dosagem de fosfatase alcalina (FA) aumentou aos 14 dias em todos os grupos, com redução temporal subsequente. Proteínas ósseas foram expressas na reação em cadeia da polimerase em tempo real e puderam confirmar a diferenciação óssea em todos os grupos. A osteopontina teve sua maior expressão no G-PRP aos sete dias, seguido do grupo G-PRP+MOD... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:This study aimed to isolate MSCs from canine Wharton's jelly umbilical cord and evaluate in vitro the effect of PRP and the MOD in osteogenic differentiation of these cells in the absence of osteogenic medium. Cells were isolated and characterized as undifferentiated mesenchymal cells with a phenotype fibroblasts-like and characteristic phenotype of confirmed by flow cytometry with CD44 +, CD105 +, CD271 +, CD34-and CD45-, plus the ability to differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteocytes. Except for the control group (MSCs), in all groups, G-PRP (PRP and MSCs), G-DBM (DBM and MSCs) and G-PRP + DBM (MSCs and PRP + DBM) was differentiation osteoblastic with production of mineralized bone matrix confirmed by Alizarin red staining. The measurement of alkaline phosphatase (AP) increased up to 14 days in all groups. Bone proteins were expressed in the polymerase chain reaction in real time and were able to confirm the differentiation bone in all groups. Osteopontin had its greatest expression in G- PRP to seven days followed by G-PRP + DBM, at other times the G-PRP + DBM had higher expression than the other groups. The osteocalcin and Runx2 were expressed more intensely in the G-PRP + DBM at the end of the experiment. It can be concluded that the PRP and DBM are capable of promoting osteogenesis mesenchymal cells in Wharton's jelly of the umbilical cord with canine, with advantage in the presence of DBM / Orientador: Alexandre Lima de Andrade / Banca: Rita Cássia Menegati Dornelles / Banca: Márcio Mateus Beloti / Doutor

INTRODUÇÃO: Células-tronco mesenquimais da geleia de Wharton (GW-CTM) exibem a capacidade de modular a resposta das células T e geralmente esses efeitos imunomoduladores são anti-inflamatórios. Devido ao seu potencial imunossupressor, as CTM emergiram recentemente como uma ferramenta promissora para terapia celular. No entanto, essas células têm uma vida útil limitada in vitro, com redução progressiva da sua capacidade de autorrenovação e parada irreversível do ciclo celular. O resultado deste processo é a perda da funcionalidade das CTM, o que limita a sua utilização para fins terapêuticos. Pouco se sabe sobre a variabilidade individual das amostras de GW-CTM e como isso poderia afetar sua expansão in vitro, seu potencial imunomodulador e o processo de envelhecimento. Neste estudo, avaliamos o perfil de citocinas imunomoduladoras e a capacidade das GW-CTM inibir a proliferação de células T durante o processo de senescência replicativa para determinar se a resposta esperada é afetada. MÉTODOS: GW-CTM foram cultivadas até a senescência replicativa ser atingida; as amostras foram coletadas numa fase inicial (passagem 5), numa etapa intermediária (passagem 15) e na senescência replicativa (passagem geralmente entre 20 e 25) para análise do perfil basal de moléculas imunomoduladoras. GW-CTM foram cocultivadas com amostras de duas células mononucleares de sangue periférico (PBMC), obtidas de doadores de plaquetas saudáveis. PBMC foi estimulado com fitohemaglutinina (PHA) durante 72 horas e cocultivado com três amostras de GW-CTM diferentes para medir a supressão da proliferação das células T. Os experimentos foram realizados utilizando as passagens P5 e P10. As análises foram feitas por PCR em tempo real, western blot e citometria de fluxo. RESULTADOS: Nossos resultados mostram que a expressão gênica e a secreção de moléculas imunomoduladoras variam entre amostras de GW-CTM, sem padrão específico. Em cocultura, todas as GW-CTM foram capazes de inibir a proliferação de células T CD3+ ativadas por mitogéno, embora em diferentes graus. E cada PBMC respondeu à cocultura com um nível diferente de inibição. Além disso, o perfil imunomodulador de todas as GW-CTM foi essencialmente mantido, mesmo após várias passagens. CONCLUSÃO: Nossos dados indicam que cada GW-CTM exibe um comportamento único, diferindo nos padrões de expressão e secreção de citocinas e capacidade imunomoduladora. Essa variabilidade intrínseca entre amostras pode influenciar a eficácia de GW-CTM quando utilizadas em terapia celular / INTRODUCTION: Wharton\'s jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSC) exhibit the ability to modulate T cell responses and these immunomodulatory effects are usually anti-inflammatory. Due to their immunosuppressive potential, MSC have recently emerged as a promising tool for cell therapy. However, MSC have a limited lifespan in vitro, with a progressive reduction in their capacity for selfrenewal leading to irreversible arrest of cell division. The result of this process is the loss of stem cell functionality, which limits its use for therapeutic purposes. Information on the variability of individual cell samples impacting upon in vitro expansion, immunomodulatory potential, and aging processes is still lacking. In this study, we evaluated the immunomodulatory cytokine profile and capacity to inhibit T cell proliferation of WJ-MSC progressing to replicative senescence to determine if the expected response is affected. METHODS: WJ-MSC were cultured until replicative senescence was reached and the samples were collected at an early stage (passage 5), at an intermediate stage (passage 15), and in replicative senescence (passage generally between 20 and 25) to analyze the basal profile of immunomodulatory molecules. WJ-MSC were co-cultured with samples from the same two peripheral blood mononuclear cells (PBMC), obtained from healthy platelet donors. PBMC were stimulated with phytohemagglutinin (PHA) for 72 hours and tested against 3 different WJ-MSC to measure suppression of T cell proliferation. The experiments were performed using passages P5 and P10. Analyses were done by real-time PCR, western blot, and flow cytometry. RESULTS: Our results show that gene expression and secretion of immunomodulatory molecules varied among WJ-MSC samples with no specific pattern discernible. In co-culture all WJ-MSC were capable of inhibiting mitogen-activated CD3+ T cell proliferation, although to different extents and each PBMC responded with its unique level of inhibition. In addition, the immunomodulatory profile of each WJ-MSC sample was essentially maintained even after several passages. CONCLUSION: Our results indicate that each WJMSC displays a unique behavior, differing in patterns of cytokine mRNA expression and immunomodulatory capacity. The intrinsic variability between samples may influence the effectiveness of WJ-MSC when employed therapeutically