Introdução: Atualmente a prostatectomia radical retropúbica tem sido responsável por grande parte dos casos de disfunção erétil de causa neurogênica. O desenvolvimento de técnicas como a cirurgia com preservação do feixe vásculo-nervoso, eletro-estimulação intra-operatória o uso de enxertos autólogos para se reestabelecer a comunicação dos nervos cavernosos têm minimizado o grau de lesão neuronal. Entretanto, faz-se necessária a criação de novos métodos de restauração do nervo cavernoso. Neste estudo, investigaremos o uso e a aplicação de células tronco adultas de medula óssea de ratos e sua capacidade para regeneração do nervo cavernosos lesado e para restauração da função erétil em ratos. Objetivo: Avaliar a influência de células tronco adultas da medula óssea de ratos na regeneração do nervo cavernosos lesado, tomando-se como parâmetro o retorno da função erétil nos animais submetidos ao teste de ereção induzido pela apomorfina. Material e Método: Quarenta e oito ratos Wistar-EPM machos, com idades entre 9 e 10 semanas, pesando aproximadamente 250 gramas foram usados e randomicamente subdivididos em quatro grupos de estudo contendo 12 animais cada. Os grupos experimentais foram divididos em: Grupo I: exposição cirúrgica bilateral nervo cavernoso sem lesão do mesmo.Grupo II: lesão cirúrgica bilateral do nervo cavernoso de aproximadamente 3 mm, sem reconstrução. Grupo III: lesão cirúrgica bilateral dos nervos cavernosos de aproximadamente 3 mm, e reconstrução bilateral com sondas guias de silicone contendo solução salina em seu interior. Grupo IV: lesão cirúrgica bilateral dos nervos cavernosos de aproximadamente 3 mm, e reconstrução bilateral com sondas guias de silicone semeadas com células-tronco adultas em seu interior. Quatro semanas após a cirurgia, os animais foram injetados com apomorfina para indução da ereção. Resultados: No grupo I observou-se resposta erétil completa em todos os animais (100% - 12 em 12). Por outro lado nenhum dos animais do grupo II apresentou ereções após a admnistração de apomorfina. Cinco dos doze animais do grupo III (41,7%) apresentaram ereções enquanto que nove dos 12 animais do grupo IV (75%) evidenciaram ereções após o estímulo. Quando foram comparadas as frequências de restauro de ereção nos quatro grupos, demonstrou-se que grupo IV teve um comportamento semelhante ao grupo I (p = 0,217), ao passo que os animais do grupo III apresentaram frequência de ereções inferiores aos do grupo I (p = 0,005). Por outro lado, a comparação dos resultados entre os grupo III e IV versus o grupo II, demostrou que a frequência de ereções foi estatisticamente superior nos dois primeiros grupos (p = 0,037 e p < 0,001, respectivamente). Finalmente, o grupo IV apresentou tendência a maior número de ereções quando comparado ao grupo III (75% versus 41,7%) mas essa diferença não foi estatisticamente significante (p = 0,098). Conclusão: O presente estudo demonstra que células tronco adultas da medula óssea, semeadas em sondas guias de silicone, favorecem a regeneração dos nervos cavernosos e promovem o reestabelecimento da função erétil em um modelo animal. / Objective: To assess the influence of adult stem cells from bone marrow of rats in the regeneration of cavernous nerve, taking as a parameter the return of erectile function in animals subjected to the test of erection induced by apomorphine. Methods: Forty-eight WISTAR-EPM male rats, aged between 9 and 10 weeks, weighing approximately 250 grams were used and randomly divided into four groups of study containing 12 animals each. The experimental groups were divided into: Group I: surgical exposure of bilateral cavernous nerves without injury. Grupo II: surgical bilateral lesion of cavernous nerve with approximately 3 mm, without reconstruction. Group III: surgical bilateral lesion of cavernous nerves of approximately 3 mm, and bilateral reconstruction with silicone tube containing saline solution inside. Group IV: surgical bilateral lesion of cavernous nerves of approximately 3 mm, and bilateral reconstruction with silicone tube containing adult stem-cells inside. Four weeks after surgery, the animals were injected with apomorphine for induction of erection. Results: In Group I there was complete erectile response in all animals (100% - 12 in 12). On the other hand none of the animals in Group II presented erection after the use of apomorphine. Five of the twelve animals of group III (41.7%) had erections while nine of the 12 animals of Group IV (75%) showed them after the stimulus. When we compared the frequency of restoration of erection in the four groups, it was shown that group IV had similar performance to the group I (p = 0,217), while the animals in Group III had a frequency of erections inferiors to the Group I (P = 0,005). Moreover, comparison of results between the group III and IV versus the group II, showed that the frequency of erections was statistically higher in the first two groups (p = 0,037 p < 0,001, respectively). Finally, the group IV presented trend the largest number of erections when compared to Group III (75% versus 41.7%) but this difference was not statistically significant (p = 0,098). Conclusion : This study shows that adult stem cells from bone marrow, sown in probes silicone guides, promote the regeneration of cavernous nerves and restore erectile function in an animal model.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-11-19T13:29:29Z No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Approved for entry into archive by Gentil Jeorgina(jeorgina@icict.fiocruz.br) on 2013-11-26T11:00:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2014-09-26T10:49:49Z No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-03-10T13:27:33Z No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-07-18T13:01:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T13:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patricia_shigunov_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 4983647 bytes, checksum: 1ca2b97e14d57fb20e3fd6931bdb6187 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As células-tronco (CTs) têm potencial de se diferenciar em vários tipos celulares servindo como um sistema de reparação de tecidos. Quando uma CT se divide mantém o mesmo potencial da célula que a originou em um mecanismo chamado de autorrenovação. O entendimento desse mecanismo ajudará a compreender a senescência e a perda do potencial de diferenciação das CTs. Em nível de regulação pós-transcricional, as proteínas DZIP1 e PUM2 estão envolvidas na autorrenovação de CT embrionárias e germinativas de diversos organismos, incluindo humanos. Contudo, o trabalho visou o estudo do envolvimento de PUM2 e DZIP1 nos mecanismos de autorrenovação e diferenciação em CTs mesenquimais humanas (CTMs). Por RT-PCR, foi observada a expressão dos transcritos de dzip1 e pum2 em CTMs derivadas de medula óssea (MO), sangue de cordão umbilical e placentário (SCU) e tecido adiposo (TA). A expressão dos transcritos também foram analisada durante a adipogênese das CTMs por qRT-PCR. Os resultados demonstram que o perfil de expressão dos dois transcritos sofre redução durante o processo, enquanto o transcrito de fabp4 (marcador adipogênico) aumenta. Por citometria de fluxo foi verificada a porcentagem de CTMs de TA que expressam DZIP1 (mais de 90% da população) e PUM2 (cerca de 50% da população). A expressão das proteínas PUM2 e DZIP1 foi confirmada por western blot em extratos totais de CTMs. Durante a diferenciação celular, a expressão da proteína DZIP1 se manteve constante enquanto PUM2 sofreu redução após induzida da diferenciação. A discrepância entre os níveis de mRNA e da proteína DZIP1 sugere regulação pós-transcricional. As imunofluorescências de DZIP1 e PUM2 nas CTMs indicaram que essas proteínas são nucleares em células de culturas recém sub-cultivadas e a localização dessas são translocadas para o citoplasma ao longo do tempo da cultura. As células diferenciadas expressam as duas proteínas no citoplasma e/ou núcleo. Análise dos transcritos de dzip1 e pum2 também foi verificada em culturas com proliferação celular intensa e reduzida. Dzip1 não apresentou mudanças significativas de expressão nas duas situações. No entanto, a expressão de pum2 aumentou nas CTMs com proliferação intensa, sugerindo uma possível participação nesse processo. Ensaios futuros serão realizados para confirmar a participação de PUM2 na proliferação celular. Além disso, a interferência de dzip1 e pum2 por RNA será providenciada para análise funcional desses genes. / Stem Cells (SCs) have the potential of differentiating into several cellular types, serving as a repair system for the organism. The ability of stem cells to replicate themselves by dividing into the same non-specialized cell type over long periods is a mechanism knows as self-renewal. The understanding of this mechanism will also help to understand the senescence and hence, the loss of SCs differentiation potential. PUMILIO2 and DZIP1 RNA binding proteins regulate the translation of specific mRNAs during self-renewal and differentiation of germ-line and embryonic stem cells of diverse organisms, including humans. In this work, we aimed to study the relevance of PUM2 and DZIP1 in self-renewal and differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs). We have found that dzip1 and pum2 transcripts are expressed in hMSCs derived from bone marrow (BM), adipose tissue (AT) and umbilical cord blood (UC) by using RT-PCR analysis. We have found that more than 90% of the MSCs population express DZIP1 and about 50% express PUM2 by flow cytometry. The expression pattern of pum2 and dzip1 transcripts was followed during differentiation of adipose derived MSCs into adipocytes. Quantitative PCR analysis showed that mRNA levels of both genes drop during differentiation, showing an opposite pattern to the fabp4 adipocyte marker. The presence of the PUM2 and DZIP1 proteins was confirmed by western blot of total protein extracts of AT derived hMSCs. During cell differentiation, the expression of the protein DZIP1 was constant while PUM2 decreased. The discrepancy between the levels of the dzip1 mRNA and protein suggests a regulated transcriptional and post-transcriptional expression of these genes. DZIP1 and PUM2 in immunofluorescence assays in hMSCs indicated that they are nuclear in freshly plated cells and translocate to the cytoplasm over time. The differentiated cells present the two proteins in the cytoplasm and nucleus. The expression pattern of the dzip1 and pum2 transcripts was also followed in cultures of MSCs derived from AT undergoing intense and reduced cell proliferation. Dzip1 showed no significant changes of expression in both situations. However, the expression of pum2 is higher in hMSCs with intensive proliferation than with reduced proliferation suggesting a possible participation in this process. To pave the way to a better understanding of DZIP1 and PUM2 function in hMSCs, RNA interference experiment are in progress.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introducao: Um dos objetivos da Medicina e superar os danos causados ao organismo por doencas, senilidade e traumas, restabelecendo um equilibrio normo-funcional. Nas perdas teciduais, inumeros autores afirmam que o substituto gideal h e o proprio tecido saudavel, de mesma origem ou o tecido produzido por Engenharia Tecidual (ET). Porem, ainda sao necessarias muitas pesquisas para a utilizacao in vivo. Objetivo: Avaliar tres suplementos hemoderivados, empregados em meios de cultivo, quanto a proliferacao celular e o dano celular de celulas-tronco de origem dentaria. Metodos: Foram realizados cinco experimentos a partir de dentes terceiros molares em desenvolvimento. Apos a digestao enzimatica, as celulas-tronco adultas foram cultivadas em quatro diferentes meios de cultivo. Meio I, isento de suplemento hemoderivado; meio II, suplementado com FBS (heterologo); meio III, suplementado com soro humano homologo; meio IV, suplementado com soro humano autologo. Essas culturas foram analisadas comparativamente quanto a proliferacao celular, submetidas a testes com marcadores Von Kossa e Alizarina Vermelha durante quatro semanas (avaliadas semanalmente) e a cada duas semanas quanto as unidades formadoras de colonias (UFCs). No 28o dia as quatro culturas foram submetidas ao teste do gcometa h, analisando-se possivel dano no DNA celular. Os resultados foram submetidos a analise estatistica de Variancia de Friedman, estabelecendo-se significancia para (p) . a 5%. Resultados: O meio de cultivo IV atingiu uma proliferacao celular superior ao Meio I, demonstrando um resultado significante (p*=0,0074). O meio de cultivo II, mostrou proliferacao superior ao meio I e desenvolvimento semelhante ao meio III, porem nenhum demonstrou significancia em relacao ao meio IV. Os resultados do teste do cometa evidenciaram um menor dano celular nas culturas do meio IV em relacao ao meio II e meio III. As UFCs foram numerosas nos meios IV e III respectivamente, havendo maior indice de mineralizacao no meio IV do que nos meios II e III. Conclusao: O meio de cultivo suplementado com hemoderivado autologo favoreceu significativamente a proliferacao celular. O hemoderivado humano mostrou-se viavel como suplemento nas culturas de celulas-tronco dentarias humanas. / Introduction: One among many aims of medicine is to overcome injuries inflicted to the organism by diseases, aging and trauma, re-establishing the usual functions. About tissues losses, several authors claim that the ideal replacement is the healthy tissue itself, originated from the same source or developed by Tissue Engineering (TE). However, much research is needed before in vivo application. Objective: To evaluate three different kinds of sera supplies used in stem cell culture media, as to cellular proliferation and cellular injuries on dental stem cell. Methods: Five experiments were made utilizing incompletely developed third molar teeth. After enzymatic digestion, the adult stem cells were cultivated in four different kinds of culture media. Medium I, serum free (SF); medium II, supplied with FBS (heterologous serum- HeS); medium III, supplied with homologous human serum (homologous serum- HoS) and medium IV, supplied with autologous human serum (autologous serum . AuHS).These cultures were analyzed comparatively as to cellular proliferation; they were submitted Von Kossa (VK) and Alizarin Red (AR) markers tests for four weeks (checked weekly), and each two weeks checked for Colonies Forming Unities (CFUs). On the 28th day, all four cultures were submitted to comet assay, and were inspected for possible cellular DNA injuries. The results underwent a non-parametric statistical Friedman fs variance test, with significance (p) . 5%. Results: Culture medium IV reached a cellular proliferation rate higher than medium I, showing a significant result (p*=0,0074). Culture medium II presented a superior proliferation result than medium I, and similar to medium III, although neither of them presented significant result when compared to medium IV. The comet assay fs results showed minor cellular DNA injury in the medium IV cultures, when compared to medium II and III cultures. The CFUs were numerous in the media IV and III cultures, respectively, and there was higher mineralization rate in the medium IV than in the media II and III. Conclusion: The culture medium supplied with AuHS significantly improved cellular proliferation. Human sera proved to be a viable supply to human dental stem cell culture. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

INTRODUÇÃO: As células-tronco mesenquimais (CTM) são células adultas multipotentes capazes de se diferenciarem em várias linhagens celulares. Estudos com CTM derivadas do cordão umbilical humano (CUh), mais especificamente da Geleia de Wharton (GW), tem demonstrado um grande potencial para a terapia de reposição celular e regeneração tecidual. O papel dos genes de resistência a múltiplas (MDR) drogas, tais como ABCB1 e LRP é bem conhecido nos processos de regulação, fisiologia e defesa. Entretanto, nenhum estudo demonstrou ainda a presença desses genes nas CTM da GW do CUh. Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar a expressão de Pg-p e LRP em CTM derivadas da GW. MATERIAIS E MÉTODOS: CTMs da GW isoladas de CUh (n = 20) foram caracterizadas quanto ao seu estado indiferenciado por: citometria de fluxo; expressão de genes Oct-4 e Nanog por RT-PCR e capacidade de diferenciação adipogênica e osteogênica in vitro. Foi analisado ainda a expressão dos genes ABCB1 e LRP por RT-PCR em tempo real de células indiferenciadas. A resistência a doxorrubicina (DOX) foi determinada através do ensaio de MTT nessas mesmas amostras. RESULTADOS: As CTM da GW do CUh apresentaram positividade para marcadores de superfície presentes nas CTM, tais como, CD29, CD44, CD90 e CD105. Os genes de indiferenciação celular Oct-4 e Nanog foram expressos em todas as amostras, que também foram capazes de se diferenciar em adipócitos e osteócitos, comprovando assim que essas células são CTM. Com relação à Pg-p, o gene ABCB1 não amplificou em 18 amostras sendo que somente 2 apresentaram baixa expressão gênica. O gene LRP amplificou de forma intensa em todas as amostras analisadas. CONCLUSÃO: Concluímos que as CTM derivadas da GW do CUh apresentam um elevado nível de expressão de LRP, sugerindo que este gene pode estar envolvido no processo de regulação das células-tronco mesenquimais, bem como na fisiologia e defesa celular / INTRODUCTION: Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent adult cells that can differentiate into various cell lineages. Studies with MSC derived from human umbilical cord (hUC), more specifically from Wharton jelly (WJ), have shown great potential for cellular replacement therapy and tissue regeneration. The role of multidrug resistance genes, such as ABCB1 and LRP is well known in the regulation, physiology and cellular defense. However, the presence of these genes in the MSC of the WJ from hUC was not demonstrated yet. The aim of this study was to analyze the expression of Pg-p and LRP in MSCs derived from WJ. MATERIALS AND METHODS: The MSC from WJ were isolated from hUC (n = 20) and were characterized by: flow cytometry; Oct-4 and Nanog gene expression by RT-PCR and adipogenic and osteogenic in vitro differentiation capability of these cells. It was also analyzed gene expression of ABCB1 and LRP by real time RT-PCR of undifferentiated cells. Doxorubicin (DOX) resistance was determined by MTT assay in all the samples. RESULTS: MSC WJ from hUC was positive for MSC surface markers, such as CD29, CD44, CD90 and CD105. The undifferentiated cell genes Oct-4 and Nanog were expressed in all samples, which were also capable to differentiate into adipocytes and osteocytes, proving that these cells are MSC. Concerning to Pgp, the ABCB1 gene, 18 samples didn\'t show any amplification product (no expression) while 2 showed little gene expression. The LRP gene amplified intensely in all samples. CONCLUSION: We conclude that MSC derived from the WJ hUC have a high level of LRP expression, suggesting that this gene may be involved in the regulation of mesenchymal stem cells as well as in physiology and cellular defense

Introdução: Atualmente a prostatectomia radical retropúbica tem sido responsável por grande parte dos casos de disfunção erétil de causa neurogênica. O desenvolvimento de técnicas como a cirurgia com preservação do feixe vásculo-nervoso, eletro-estimulação intra-operatória o uso de enxertos autólogos para se reestabelecer a comunicação dos nervos cavernosos têm minimizado o grau de lesão neuronal. Entretanto, faz-se necessária a criação de novos métodos de restauração do nervo cavernoso. Neste estudo, investigaremos o uso e a aplicação de células tronco adultas de medula óssea de ratos e sua capacidade para regeneração do nervo cavernosos lesado e para restauração da função erétil em ratos. Objetivo: Avaliar a influência de células tronco adultas da medula óssea de ratos na regeneração do nervo cavernosos lesado, tomando-se como parâmetro o retorno da função erétil nos animais submetidos ao teste de ereção induzido pela apomorfina. Material e Método: Quarenta e oito ratos Wistar-EPM machos, com idades entre 9 e 10 semanas, pesando aproximadamente 250 gramas foram usados e randomicamente subdivididos em quatro grupos de estudo contendo 12 animais cada. Os grupos experimentais foram divididos em: Grupo I: exposição cirúrgica bilateral nervo cavernoso sem lesão do mesmo.Grupo II: lesão cirúrgica bilateral do nervo cavernoso de aproximadamente 3 mm, sem reconstrução. Grupo III: lesão cirúrgica bilateral dos nervos cavernosos de aproximadamente 3 mm, e reconstrução bilateral com sondas guias de silicone contendo solução salina em seu interior. Grupo IV: lesão cirúrgica bilateral dos nervos cavernosos de aproximadamente 3 mm, e reconstrução bilateral com sondas guias de silicone semeadas com células-tronco adultas em seu interior. Quatro semanas após a cirurgia, os animais foram injetados com apomorfina para indução da ereção. Resultados: No grupo I observou-se resposta erétil completa em todos os animais (100% - 12 em 12). Por outro lado nenhum dos animais do grupo II apresentou ereções após a admnistração de apomorfina. Cinco dos doze animais do grupo III (41,7%) apresentaram ereções enquanto que nove dos 12 animais do grupo IV (75%) evidenciaram ereções após o estímulo. Quando foram comparadas as frequências de restauro de ereção nos quatro grupos, demonstrou-se que grupo IV teve um comportamento semelhante ao grupo I (p = 0,217), ao passo que os animais do grupo III apresentaram frequência de ereções inferiores aos do grupo I (p = 0,005). Por outro lado, a comparação dos resultados entre os grupo III e IV versus o grupo II, demostrou que a frequência de ereções foi estatisticamente superior nos dois primeiros grupos (p = 0,037 e p < 0,001, respectivamente). Finalmente, o grupo IV apresentou tendência a maior número de ereções quando comparado ao grupo III (75% versus 41,7%) mas essa diferença não foi estatisticamente significante (p = 0,098). Conclusão: O presente estudo demonstra que células tronco adultas da medula óssea, semeadas em sondas guias de silicone, favorecem a regeneração dos nervos cavernosos e promovem o reestabelecimento da função erétil em um modelo animal. / Objective: To assess the influence of adult stem cells from bone marrow of rats in the regeneration of cavernous nerve, taking as a parameter the return of erectile function in animals subjected to the test of erection induced by apomorphine. Methods: Forty-eight WISTAR-EPM male rats, aged between 9 and 10 weeks, weighing approximately 250 grams were used and randomly divided into four groups of study containing 12 animals each. The experimental groups were divided into: Group I: surgical exposure of bilateral cavernous nerves without injury. Grupo II: surgical bilateral lesion of cavernous nerve with approximately 3 mm, without reconstruction. Group III: surgical bilateral lesion of cavernous nerves of approximately 3 mm, and bilateral reconstruction with silicone tube containing saline solution inside. Group IV: surgical bilateral lesion of cavernous nerves of approximately 3 mm, and bilateral reconstruction with silicone tube containing adult stem-cells inside. Four weeks after surgery, the animals were injected with apomorphine for induction of erection. Results: In Group I there was complete erectile response in all animals (100% - 12 in 12). On the other hand none of the animals in Group II presented erection after the use of apomorphine. Five of the twelve animals of group III (41.7%) had erections while nine of the 12 animals of Group IV (75%) showed them after the stimulus. When we compared the frequency of restoration of erection in the four groups, it was shown that group IV had similar performance to the group I (p = 0,217), while the animals in Group III had a frequency of erections inferiors to the Group I (P = 0,005). Moreover, comparison of results between the group III and IV versus the group II, showed that the frequency of erections was statistically higher in the first two groups (p = 0,037 p < 0,001, respectively). Finally, the group IV presented trend the largest number of erections when compared to Group III (75% versus 41.7%) but this difference was not statistically significant (p = 0,098). Conclusion : This study shows that adult stem cells from bone marrow, sown in probes silicone guides, promote the regeneration of cavernous nerves and restore erectile function in an animal model.

Células-tronco adultas podem ser isoladas de vários tecidos, dentre eles a polpa dentária humana, tecido originado na papila dentária do dente em desenvolvimento. Estas linhagens multipotentes podem ser estudadas sob vários aspectos, como na elucidação da histogênese de tumores. O objetivo deste estudo foi inferir a histogênese do mixoma odontogênico, neoplasia odontogênica benigna, analisando a expressão de proteínas da matriz extracelular (MEC) e de metaloproteinases da matriz (MMPs) em células-tronco adultas de polpa dentária humana. Três linhagens diferentes de células-tronco originadas de polpas dentárias humanas IDPSCs (DL-1, DL-2 e DL4) foram utilizadas. As proteínas analisadas foram as mesmas expressas na neoplasia: vimentina, colágeno tipo I, fibronectina, tenascina, ácido hialurônico e MMPs (MMP-1, MMP-2 e MMP-9). Imunofluorescência e ensaios enzimáticos foram utilizados para analisar a presença de proteínas nas células cultivadas e no meio de cultura condicionado por estas células, respectivamente. Todas as linhagens celulares expressaram a vimentina e nenhuma expressou o ácido hialurônico. A linhagem celular DL-1 expressou todas as outras proteínas da matriz extracelular estudadas, enquanto que na linhagem DL-2 apenas não foi observada a expressão do colágeno tipo I. Fibronectina e tenascina não foram observados na linhagem DL-4. Todas as linhagens expressaram todas as MMPs, sendo que a produção de MMP-2 nas três linhagens foi significantemente maior que a de todas outras MMPs. Baseado nas condições deste estudo, é possível concluir que a expressão de proteínas da MEC e de MMPs em células-tronco de polpa dentária humana apresentaram perfil similar àquela apresentada no mixoma odontogênico, exceto pela ausência de marcação do ácido hialurônico em todas as linhagens. A ausência de secreção de ácido hialurônico pelas IDPSCs poderia indicar que o mixoma odontogênico deriva de uma célula mais diferenciada que as células-tronco. / Adult stem cells can be isolated from different tissues including the human dental pulp, a structure originated from the dental papillae. These cell lineages are of importance in a series of studies, as the analysis of tumors histogenesis. The aim of this study was to infer the histogenesis of odontogenic myxoma, a benign odontogenic neoplasia by analyzing the ECM and MMPs molecules expressed in human dental pulp stem cells. Three different lineages of immature dental pulp stem cells (IDPSCs) (DL-1, DL-2 and DL-4) were used. The proteins searched were those expressed by the tumoral cells: vimentin, type I collagen, fibronectin, tenascin and hialuronic acid (HA) and the matrix metalloproteinases (MMP-1, MMP-2 and MMP-9). Immunofluorecence and enzymatic assays were used for analyzing the presence of the proteins in the cells and in the culture media conditioned by the cells, respectively. All the lineages expressed vimentin; however none expressed HA. DL-1 lineage expressed all the other ECM proteins, and the expression of type I collagen was not observed in the DL-2 lineage. Fibronectin and tenascin were not observed in the DL-4 lineage. All the lineages expressed all the MMPs. The release of MMP-2 from all cell lineages was significantly higher than those of all other MMPs. Based on the conditions of this study its possible to conclude that the overall expression of MEC proteins and MMPs in the lineages of human dental pulp stem cells were similar to those found in the odontogenic myxoma, except for the absence of hyaluronic acid. The absence of HA secretion by the IDPSCs could indicate that the odontogenic myxoma tumoural cells derive from a cell more differentiated than the stem cells.

Introdução. O transplante de células é possibilidade terapêutica promissora para muitas doenças neurológicas. Nos últimos anos, a possibilidade do isolamento de células-tronco dos tecidos adultos, por exemplo da medula-óssea, atrai a atenção da comunidade científica, estratégia que minimiza os problemas éticos relativos ao uso de tecido fetal para implantes visando ao tratamento de doenças neurológicas. Entretanto, a eficiência da transdiferenciação de células-tronco mesenquimais em neurônios, bem como os mecanismos envolvidos nesse processo, permanecem desconhecidos. A obtenção de neurônios maduros ocorreu somente em sistemas de co-cultura, o que induz a questão se a diferenciação representa um potencial das células per si, ou se é possível somente devido à fusão com neurônios maduros. Objetivos. No presente trabalho, pretendeu-se verificar o potencial de as células-tronco mesenquimais tornarem-se neurônios e esclarecer os possíveis mecanismos envolvidos nesse processo. Material e métodos. Células-tronco mesenquimais foram isoladas de 20 doadores voluntários normais e caracterizadas por análise de separação celular ativada por fluorescência. A multipotencialidade foi investigada ao se diferenciar as células em condrócitos e osteócitos. A capacidade de auto-renovação foi confirmada pelo ensaio de incorporação de BrdU. Ulteriormente, as células foram diferenciadas por uma semana em meio contendo AMPc, IBMX, ou combinação de ambos, e os resultados foram comparados com o cultivo em meio básico. Diferentes bloqueadores de Ca2+ ou inibidores de PKA foram usados como tentativa de se impedir a diferenciação, ocorrência que foi mensurada com imunocitoquímica para NF-200 (marcador de neurônios maduros). O registro eletrofisiológico por meio de patch clamp foi usado para se confirmar o fenótipo neuronal. As figuras foram configuradas em microscopia confocal. Para análise estatística foi utilizada ANOVA com teste post-hoc. Resultados. As células isoladas expressaram CD90, 105, 44 e 13 mas foram negativas para CD34 e 45. Isto significa que não são de origem hematopoiética; 98,74 ± 0,43% das células incorporaram BrdU em 24 horas. Após o isolamento, foi possível diferenciá-las em condrócitos ou osteócitos. Em situação controle, não foram evidenciadas células positivas para NF200. Por outro lado, ocorreu positividade em 10,75% ± 1,35 (p<0,0001) das células sob IBMX e, em 15,18% ± 1,12, sob a combinação cAMP e IBMX (p<0,0001). Foram registradas correntes de Na+ e K+ dependentes de voltagem, mas não potenciais de ação. A diferenciação foi inibida com PKAi (5,73% ± 0,42, p<0,0001), nifedipina (5,79% ± 0,98, p<0,0001), Ni2+ (7,06% ± 1,68, p<0,0001) e Cd2+ (0 ± 0, p<0,0001). Discussão. Isolou-se uma população de células-tronco estromais da medula-óssea de seres humanos que se mostrou multipotencial e auto-renovável. O aumento da concentração de AMPc no meio elevou a concentração de neurônios para 15%. A diferenciação parece depender da via PKA mas também envolve a concentração intracelular de Ca2+. Conclusão. O correto entendimento de como as células-tronco mesenquimais diferenciam-se pode contribuir para aumentar a eficácia do método e, talvez um dia, tornar possível o uso dessa ferramenta no campo clínico. / Introduction. Cell transplantation has been considered a promising therapeutic approach for many neurological diseases. The possibility of isolation of stem cells from adult tissues, i.e. bone marrow, has attracted the attention of the scientific community in the recent years. This strategy is interesting on avoiding the ethical issues regarding the use of fetal tissue for neural implants. Moreover, the efficiency of the transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into neurons, and the mechanisms involved in this process remain largely unknown. The obtention of mature neurons was described only in coculture systems, what raised the question if the differentiation is a potential of the cells itself, or if it is possible only due to fusion with mature neurons. Objectives. In the present investigation, we aimed to verify the potential of MSCs to differentiate into neurons, and also to clarify the possible mechanisms involved on it. Material and methods. MSCs were isolated from 20 healthy human subjects and characterized by FACS-analysis. Multipotentiality was addressed by differentiating them into chondrocytes and osteocytes. The self-renewal capacity was confirmed with BrdU-incorporation assay. Afterwards, cells were differentiated for 1 week in a medium containing cAMP, IBMX, or a combination of both, and the results were compared with cells treated in basal-medium condition. Different Ca2+-blockers and PKA-inhibitor peptide were used on an attempt to impair differentiation, which was quantified with NF-200 immunostaining (a marker of mature neurons). Patch-clamp recording was used to confirm neuronal phenotype. Pictures were taken in confocal microscope. For statistical analysis ANOVA with a post-hoc test was used. Results. The isolated cells expressed CD90, 105, 44, and 13, but were negative for CD34 and 45, meaning that they were non-hematopoiethic; 98.74 ± 0.43 % of them incorporated BrdU in 6hs. After isolation, they differentiated into chondrocytes and osteocytes. In a control situation, no NF200 positive cell was seen. On the other hand, 10.75% ± 1.35 (p<.0001) of positivity was seen under IBMX and 15.18% ± 1.12 in the combination of cAMP with IBMX (p<.0001). Na+ and K+-voltage gated currents were recorded. Differentiation was impaired with PKAi (5.73% ± 0.42, p<.0001), nifedipin (5.79% ± 0.98, p<.0001), Ni2+ (7.06% ± 1.68, p<.0001), and Cd2+ (0 ± 0, p<.0001). Discussion. We were able to isolate a population of stromal stem cells from the bone marrow of human subjects, since they were multipotential and self-renewable. Increasing the concentration of cAMP raised the percentage of neurons up to 15%. The differentiation seems to be dependent on the PKA pathway, but also involved the intracellular concentration of Ca2+. Conclusions. The complete understanding of how MSC differentiate can contribute to increase the efficiency of the method and thus make possible to use this powerful tool in the clinical practice.

INTRODUÇÃO: As células-tronco hematopoiéticas (CTH) do sangue do cordão umbilical (SCU) têm sido utilizadas com sucesso para o tratamento de doenças malignas e não malignas. No entanto, algumas unidades de SCU podem apresentar baixa quantidade de células nucleadas totais (CNT). Algumas abordagens têm sido sugeridas para evitar problemas em relação à baixa concentração de CTH no transplante, como a administração de duas unidades de SCU para o paciente e a expansão ex vivo de CTH. OBJETIVO: Avaliar as taxas de proliferação celular na expansão ex vivo do SCU em sistema de cocultura com células-tronco mesenquimais (CTM) obtidos a partir de diferentes fontes com alta e baixa confluência e adicionando-se ou não coquetel de citocinas no meio de cultura. MÉTODOS: Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisa (CAPPesq) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. A coleta do SCU (n =10) foi realizada após o nascimento do bebê e expulsão da placenta. O processamento foi realizado utilizando o método de redução de volume, o qual consiste em depleção de eritrócitos. As amostras de CTM provenientes do endotélio vascular do cordão umbilical foram obtidas de doadores diferentes (n=3) e o tecido adiposo (n=3) do inventário do LIM-31. A expansão das CNT e das células com expressão de marcadores CD133+/CD34+ foram observados depois de sete dias de cultura. Além disso, o ensaio para análise de unidades de formadoras de colônias (UFC) foi realizado em todas as amostras antes e depois da expansão do SCU. Para a expansão em sistema de cocultura foi separado dois grupos para ambas as fontes de CTM (Grupo I - cocultura com adição de coquetel de citocinas vs. Grupo II - cocultura sem citocinas). RESULTADOS: Após sete dias, no grupo I com cocultura confluente, a taxa de proliferação de CNT foi duas vezes maior ao comparar com cocultura subconfluente (35 vs. 16 vezes). No mesmo grupo também foi possível evidenciar elevada taxa de proliferação de células CD133+/CD34+. O índice de proliferação das UFC no grupo I aumentou até oito vezes. A cocultura subconfluente tanto do endotélio vascular do cordão umbilical como do tecido adiposo apresentou menor rendimento em comparação as CTM confluentes. A expansão das células na presença de citocinas apresentou maior proliferação celular ao comparar às coculturas sem adição de citocinas. CONCLUSÃO: Este estudo mostrou que para alto rendimento de células do SCU, o sistema de cocultura requer adição de coquetel de citocinas e CTM confluente independentemente da fonte utilizada / INTRODUCTION: Umbilical cord blood (UCB) hematopoietic stem cells have been successfully used for the treatment of both malignant and non-malignant diseases. Nevertheless, some UCB units could have low total nucleated cells (TNC) dose. Several approaches have been suggested to avoid inadequacy problems of hematopoietic stem cells (HSC) number for transplantation, such as administration of two UCB units to the patient and HSC ex vivo expansion. OBJECTIVE: Evaluate UCB ex vivo expansion proliferative rates in a high and low mesenchymal stem cells (MSC) confluence feeder layer obtained from different MSC sources and by adding or not cytokines cocktail into the medium. METHODS: This study was approved by the Research Ethic Committee (CAPPESQ) of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. The collection of UCB (n=10) was made after delivery of the infant and the expulsion of placenta. Processing was performed using volume reduction method which consists in red blood depletion. MSC samples from umbilical cord endothelium were obtained from three different donors and adipose tissue (n=3) obtained from LIM31\'s pattern inventory. The total nucleated cell (TNC), expression of hematopoietic surface markers such as CD133+/CD34+ were observed after seven days of culture. Beyond that, colony forming unit assay (CFU) was performed before and after UCB expansion. The expansion by coculture method was observed in two groups (Group I - coculture with cytokines cocktail added vs. Group II- coculture without cytokines cocktail) for both MSCs sources. RESULTS: After seven days, analysis of confluent coculture showed that TNC proliferation rate ware almost 2 times higher than in subconfluent coculture (35 vs. 16-fold) in Group I and also revealed higher proliferative rate in CD133+/CD34+ cells considering. CFU showed similar increase after seven days of culture in comparison of day 0 (up to 8-fold). Subconfluent coculture for both umbilical cord endothelium and adipose tissue showed lower yield compared with those with high MSC confluence. The expansion in the presence of cytokines showed higher cell proliferation compared to the cocultures without addition of cytokines. CONCLUSION: This study showed that coculture system may require the addition of cytokines cocktail in the media and confluent MSC regardless of source for high yield of UCB cells

Uma das principais complicações inerentes ao transplante de células-tronco hematopoiéticas é a doença do enxerto contra hospedeiro (DECH), que se trata da resposta imunológica contra os tecidos do receptor pelas células T do doador contidas no transplante. Este quadro é responsável por 15-30% das mortes que ocorrem após o transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas. Apesar dos recentes avanços para reduzir a incidência de DECH através de alternância de regimes profiláticos reduzindo a intensidade do condicionamento, são poucos os tratamentos efetivos. Recentemente, o potencial imunomodulador das células-tronco mesenquimais tornou-se o foco de vários estudos. Alguns autores descreveram a atuação destas células na redução da resposta imunológica através da inibição da proliferação de células T, representando um novo potencial terapêutico para DECH. Mediante esse conhecimento, investigamos o papel das células-tronco mesenquimais na proliferação, apoptose e na produção de citocinas por linfócitos T. Nossos resultados mostraram que a presença de células-tronco mesenquimais nas culturas regulam negativamente a proliferação de linfócitos T estimulados de forma independente de contato e a apoptose de forma parcialmente dependente de contato. Observamos também que linfócitos T virgens em diferenciação para Th17 na presença de células-tronco mesenquimais apresentam redução na capacidade de produzir duas importantes citocinas efetoras implicadas na DECH, o interferon gama (IFN-y) e a interleucina 17A (IL-17A). Investigamos se a prostaglandina E2 (PGE2), por depletar triptofano, estava envolvida com a diminuição de proliferação de linfócitos T quando em cultivo com células-tronco mesenquimais. Utilizamos nas culturas a indometacina (IDT), um anti-inflamatório bloqueador de cicloxigenase (COX 1 e 2) e portanto da via da PGE2. Entretanto, observamos que o bloqueio da via da PGE2 inibia ainda mais a proliferação de linfócitos T e isto ocorria de acordo com a dose de IDT. Com o resultado deste experimento concluímos que, se a proliferação de linfócitos é inibida pela depleção de triptofano do meio, ela não ocorre via PGE2. Entretanto ainda não conseguimos esclarecer se esta via é ativada por outras moléculas, ou se é esta a via realmente responsável pela inibição da proliferação de linfócitos. No que concerne a via de inibição de apoptose, mostramos que a cadeia alpha do receptor de IL-7 (CD127) está aumentada na superfície de linfócitos T quando em presença de células-tronco mesenquimais. Verificamos que o bloqueio de IL-7 nas culturas aumenta a apoptose em linfócitos, bem como sua adição causa diminuição de apoptose. Identificamos a produção intracelular de IL-7 nas células-tronco mesenquimais, relacionando estas células e IL-7 com a inibição de apoptose em linfócitos T nestas condições. Este trabalho gerou dados que permitiram a compreensão de alguns possíveis mecanismos pelos quais as MSCs podem atuar sobre linfócitos T ativados e/ou alorreativos; mecanismos estes que podem ser utilizados como base para futuras investigações na elucidação e prevenção da DECH / A major complication after hematopoietic stem cell transplantation is the graft versus host disease (GVHD), which is an immunological response of transplanted donor T cells against the recipient tissues; this outline is responsible for 15-30% of deaths that can occur after allogeneic hematopoietic stem cells transplant. Despite recent advances in reducing GVHD incidence by alternating prophylactic regimens, thus reducing the intensity of conditioning, there are few effective treatments. Recently, the immune modulatory potential of mesenchymal stem cells has become the focus of several studies. Some authors described the role of these cells in reducing immune response by inhibiting T cell proliferation, representing a potential new therapy for GVHD. Through this knowledge, we investigated the mesenchymal stem cells role into T lymphocytes proliferation, apoptosis and cytokine production. Our results showed that the presence of mesenchymal stem cells into the cultures downregulates the proliferation of stimulated lymphocytes independent of contact and apoptosis of stimulated lymphocytes in partially contact-dependent manner. We also observed during naive T lymphocytes differentiation into Th17 cells, that the mesenchymal stem cell presence reduces the lymphocyte ability in producing the GVHD major effectors cytokines, interferon gamma (IFN-y) and interleukin-17A (IL-17A). We investigated whether prostaglandin E2 (PGE2) was involved in the reduction of T lymphocytes proliferation, when cultured with mesenchymal stem cells, by tryptophan depletion. Indomethacin (IDT), an anti-inflammatory drug blocker of cyclooxygenase (COX 1 and 2) and therefore PGE2 pathway, was used. However, we observed that, according to IDT dose, blocking this pathway further inhibited lymphocyte proliferation. With this result we conclude that if lymphocyte proliferation is inhibited by tryptophan depletion, it does not occur via PGE2. However, we still cannot say whether this pathway is activated by other molecules, or if this pathway is actually responsible for T lymphocytes proliferation inhibition. Regarding the apoptosis inhibition in T lymphocytes, we show that the IL-7 receptor alpha chain (CD127) is increased on the surface of T lymphocytes when in the presence of mesenchymal stem cells. We found that IL-7 blockage in the cultures increases apoptosis in T lymphocytes, as well as their addition causes apoptosis decrease. We also identified the intracellular production of IL-7 on mesenchymal stem cells, linking these cells and IL-7 directly with apoptosis inhibition in T lymphocytes under these conditions This work has generated data that allowed the understanding of some possible mechanisms by which MSCs can act on activated and/or alloreactive T lymphocytes; mechanisms that can be used as a basis for future research in the elucidation and prevention of GVHD

Os defeitos da calota craniana causados por traumas severos, neoplasias, cirurgias ou deformidades congênitas representam um grande desafio para os cirurgiões. O uso de enxertia óssea autóloga continua sendo o método de tratamento padrão ouro, embora apresente morbidade na área doadora e seja considerado insuficiente para reconstrução de grandes defeitos. Recentemente, com o advento da bioengenharia tecidual, novas expectativas surgiram na regeneração óssea. O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo experimental em ratos para o estudo de deformidades craniofaciais e verificar se as células-tronco humanas provenientes de dentes decíduos seriam capazes de regenerar defeitos críticos em calota craniana de ratos não imunossuprimidos. Foram realizados dois defeitos ósseos de espessura total com diâmetro de 5 x 8 mm na região biparietal. O lado esquerdo foi preenchido com membrana de colágeno, enquanto o lado direito com membrana de colágeno associada a células-tronco humanas provenientes de dentes decíduos. Essas células foram caracterizadas previamente in vitro como células mesenquimais. A eutanásia dos animais foi realizada no 7º, 21º, 30º e 60º dia de pós-operatório e amostras de tecido ósseo foram extraídas para realização da análise histológica. A análise da presença de células humanas no novo osso formado foi confirmada através do estudo molecular. A linhagem de células-tronco humanas provenientes de dentes decíduos foi positiva para células-tronco mesenquimais e sua diferenciação em tecido ósseo também foi evidenciada in vitro. Foi observada a formação óssea após 21 dias de cirurgia nos dois lados, sendo o lado direito um osso mais maduro. A reação da cadeia de polimerase para DNA humano foi amplificada apenas no lado direito demonstrando que existiam células humanas nesse novo osso formado. O uso de células-tronco de dentes decíduos humanas em ratos não imunossuprimidos não evidenciou rejeição durante o período estudado. Os achados sugerem que o modelo experimental descrito poderá ser utilizado para o estudo dos defeitos ósseos cranianos em cirurgia craniofacial e que o uso de células-tronco humanas provenientes de dentes decíduos associado à membrana de colágeno parece representar uma importante estratégia para a reconstrução de tecidos ósseos e seu uso pode ser considerado uma opção para o reparo de grandes defeitos ósseos cranianos. / Repair of bone defects caused by severe trauma, resection of tumors, and congenital deformity remains a big challenge to surgeons. As a gold standard for the treatment of bone defects in clinic, autologous bone grafts are usually limited by considerable donor site mobility and available supply of tissue that can be harvested. Recently, tissue engineering has become a promising approach for bone regeneration. The main aim of this study is to create an experimental surgical protocol and evaluate the capacity of human dental pulp stem cells isolated from deciduous teeth, to reconstruct critical size cranial bone defects in nonimmunosuppressed rats. Bilateral 5 x 8 mm cranial full-thickness defects of parietal bone were created. The left side was supplied with collagen membrane only and the right side with collagen membrane and human dental pulp stem cells. Cells were used after in vitro characterization as mesenchymal cells. Animals were euthanized at 7, 21, 30 and 60 days postoperatively and cranial tissue samples were taken from the defects for histologic analysis. Analysis of the presence of human cells in the new bone was confirmed by molecular analysis. The human dental pulp stem cells lineage was positive for the four mesenchymal cell markers tested and showed osteogenic in vitro differentiation. The bone formation was observed 21 days after surgery on both sides, but a more mature bone was present in the right side. Human DNA was polymerase chain reaction-amplified only at the right side, indicating that this new bone had human cells. The use of human dental pulp stem cells in nonimmunosuppressed rats did not cause any graft rejection during this period. Our findings suggest that surgical protocol created may ultimately be used in experimental studies of cranial bone defects in craniofacial surgery and the use of human dental pulp stem cells together with collagen membrane seems to be a promising strategy for in vivo bone tissue reconstruction and their use might provide an option to repair human large cranial bone defects.