Orientador: Teresa Dib Zambon Atvars / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-20T11:35:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brunelli_DeborahDibbern_D.pdf: 7822049 bytes, checksum: 5c0e55c4eb8f38d9b5aa800764fc5426 (MD5) Previous issue date: 1994 / Doutorado

Orientador: Pedro Duarte Novaes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-03T20:24:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Salmon_CristianeRibeiro_M.pdf: 5991819 bytes, checksum: e1254b7d5e57217f7278990209c153f5 (MD5) Previous issue date: 2004 / Mestrado

Orientador: Jorge Vega / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:42:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Benatti_LucianaBenjamim_M.pdf: 648528 bytes, checksum: e64800b7819ae055ed02ec8072ec8b26 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Foram estudadas três variedades de cana-de-açúcar com diferentes graus de sensibilidade à infecção pelo vírus do amarelecimento foliar (VAFCA). As plantas mais sensíveis quando infectadas pelo VAFCA apresentam amarelecimento da nervura principal na parte abaxial, e quando o sintoma está em estádio avançado, também mostram o avermelhamento na parte adaxial da mesma nervura. Quando as variações ambientais são maiores, principalmente quando há queda da temperatura, a intensidade de sintomas é significantemente maior. A infecção viral também causa a diminuição no crescimento da planta. Análises com microscopia de epifluorescência mostraram que em algumas amostras infectadas havia um acúmulo de material fluorescente no interior do floema, sítio de localização do VAFCA. A análise comparativa entre as variedades mostrou que este material fluorescente aparecia quase que exclusivamente em folhas com sintomas da variedade sensível, SP 71-6163. Testes histoquímicos usando o reagente de Neu indicaram que o material fluorescente presente no floema é rico em flavonóides, e provavelmente insolúvel. Sabe-se que um dos mecanismos acionados na defesa de plantas contra patógenos é o aumento da atividade de peroxidases. Em testes quantitativos de três enzimas peroxidásicas diferentes foi verificado aumento significativo na atividade da siringaldazina peroxidase (SPX) apenas em plantas sensíveis, da variedade SP 81-3250, infectadas pelo VAFCA. Quanto às outras enzimas, guaiacol peroxidase (GPX) e ascorbato peroxidase (APX), as atividades sofreram poucas modificações nas variedades estudadas. Também foram feitos testes de localização da SPX, com siringaldazina como substrato e de peroxidases genéricas, com o 4-cloro-naftol como substrato. Nestes testes foi verificado que há atividade da SPX no interior do floema e nas células epidérmicas e subepidérmicas, em plantas sadias e infectadas da variedade SP 81-3250, e em folhas com e sem sintoma da SP 71-6163. Já na variedade tolerante, SP 70-1143, a atividade desta enzima foi baixa e às vezes nula. Quanto às peroxidases genéricas, houve também atividade no tecido floemático e nas células epidérmicas e subepidérmicas, mas a atividade foi similar em todas as folhas analisadas estando elas sadias ou infectadas com ou sem sintoma. Foi possível fazer uma correlação nas diferentes variedades entre concentrações de vírus e prováveis mecanismos de defesa estudados. Plantas tolerantes apresentaram muitos feixes infectados, nunca apresentam material fluorescente no floema e possuem baixa atividade SPX. Já a variedade mais sensível possui poucos feixes infectados, acúmulo de material fluorescente em folhas com sintoma, e atividade relativamente alta de SPX. Esta resposta provavelmente representa a ativação de mecanismos de defesa, que embora limitem o espalhamento do vírus na hospedeira, desencadeiam um processo que no final é mais danoso para a planta, induzindo o amarelecimento e reduzindo o crescimento / Abstract: Three varieties of sugarcane with different degrees of sensibility to infection by sugarcane yellow leaf virus (ScYLV) were studied. ScYLV belongs to the Luteovirus family. By definition they are confined to phloem tissue and one of the symptoms that can appear is the yellowing of the leaves. The more sensitive plants show the yellowing of the mid-rib on the abaxial face when infected by the ScYLV and red coloring on the same rib on the adaxial face at advanced stages. During larger environmental changes, especially temperature decreases, the symptoms may be considerably intensified. The virus infection also dimished plant growth. Epifluorescence microscopy analyses demonstrated that in some infected materials the accumulation of fluorescence material occurred inside the phloem, where the ScYLV was located. A comparative study of different varieties revealed that the fluorescent material appeared almost exclusively in leaves of the sensitive variety, SP 71-6163, showing symptoms of infection. Histochemicals testes using Neu¿s reagent indicated the fluorescent material present in the phloem to be rich in flavonóide, and probably insoluble. It is know that one of plant¿s defense mechanisms against pathogenic agents is the increase of peroxidases activities. Three different peroxidases were assayed: guaiacol peroxidase (GPX), syringaldazine peroxidase (SPX) and ascorbato peroxidase (APX). A significant increase in the SPX activity was found only in sensitive plants of the variety SP 81-3250, infected by ScYLV. The other peroxidase activities did not show significant variations in the varieties studied, probably because the plant infection was chronic. Tests to localize the SPX were made with syringaldazine as substrate and for the generic peroxidases with 4-chloro-naftol as substrate. Localization tests showed the existence of activities of SPX in the phloem, epidermis and subepidermis, in healthy and infected plants of the variety SP 81-3250. the same situation was observed in leaves of SP 71-6163 with and without symptoms. On the other hand, in the tolerant variety, SP 70-1143, the activity of SPX was low and sometimes null. The generic peroxidase activity was also localized in phloem tissue as well as in cells of the epidermis and subepidermis, but the activity was similar in all types of leaves analyzed healthy or infected with or without symptoms. It was possible to relate the quantity of virus to the probable defense mechanisms for the different varieties studied. Tolerant plants showed many infected vascular bundles, never presented fluorescent material in the phloem and possessed low activity of SPX. The most sensitive variety showed few infected vascular bundles, accumulation of fluorescent material ion the phloem of leaves with symptoms and high PX activity. This response probably represents the activation of defense mechanisms that limit the spread of the virus in the host. However, these mechanisms also trigger a process that is more harmful to the plant, inducing yellowing and growth reduction / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Biologia Vegetal

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:40:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 rafael_soares_ioc_mest_2014.pdf: 9999442 bytes, checksum: ac5e27ea1a79926391d54c0c9862a009 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A fosfatidilserina (PS) é conhecida por seu papel na regulação da apoptose e interferir em várias vias de sinalização celular. Por meio da exposição da PS, as células apoptóticas são internalizadas de forma eficiente por fagócitos, prevenindo uma resposta inflamatória. Assim, durante a evolução, alguns protozoários se utilizaram do processo chamado de \201Cmimetismo apoptótico\201D para a evasão do sistema imune do hospedeiro. O Toxoplasma gondii é um protozoário parasito intracelular obrigatório e agente etiológico da toxoplasmose. Em taquizoítos de T. gondii da cepa RH, cepa do tipo I, virulenta, cerca de 50% dos parasitos expressam PS na sua superfície. No presente trabalho foram empregadas formas bradizoítas e taquizoítas de cepa ME49, a fim de elucidar a participação das subpopulações de T. gondii, PS positivas e negativas, na infecção de células musculares esqueléticas e seu papel no desenvolvimento da cistogênese, in vitro. Para essas análises os parasitos (cistos, taquizoítos e bradizoítos) incubados com anexina-FITIC foram analisados por técnicas de citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. A parede cística e o interior dos cistos teciduais de T. gondii foram positivos para anexina, enquanto os taquizoítos e bradizoítos apresentaram subpopulações que expõem ou não PS em sua membrana A infecção de células hospedeiras por essas subpopulações de parasitos foi testada e quantificada em culturas de células musculares esqueléticas. As infecções e proliferação dos parasitos foram maiores na população total de taquizoítos em comparação com as suas subpopulações. Em infecções com bradizoítos utilizando população total e PS+ não se observou diferenças significativas, enquanto a infecção da subpopulação PS- foi significantemente menor. Quanto ao desenvolvimento da cistogênese, a infecção com taquizoítos não gerou a formação de cistos teciduais, enquanto células infectadas com bradizoítos da população total e da PS+ foram capazes de alta indução da cistogênese comparada à população PS-. Esses dados evidenciam a participação da exposição de PS em infecções pelo T. gondii e seu destino intracelular, mostrando que a exposição de PS é um fator importante que favorece o encistamento espontâneo em células musculares esqueléticas quando as culturas foram infectadas com bradizoítos / Phosphatidylserine (PS) is known for its role in regulating apoptosis and interferes with several cellular signaling pathways. Apoptotic cells, which exposure PS, are internalized efficiently by phagocytes, preventing an inflammatory response. Thus, during evolution, some protozoa use the process called "apoptotic mimicry" for evasion of the host immune system. Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite and the causative agent of toxoplasmosis. In tachyzoites of T. gondii RH strain, type I virulent, about 50% of the parasites have PS on their surface. In the present work bradyzoites and tachyzoites forms of ME49 strain, type II avirulent, were employed in order to elucidate the involvement of subpopulations of T. gondii expressing positive and negative PS, during infection of skeletal muscle cells and its role in the development of cystogenesis, in vitro. For these assays, parasites (cysts, tachyzoites and bradyzoites) were incubated with annexin-FITIC and analyzed by flow cytometry and fluorescence microscopy. Cyst wall and the matrix of tissue cysts were positive for annexin, while tachyzoites and bradyzoites showed subpopulations exposing or not PS on their surface. The able of infection and proliferation of parasites were highest in the total population of tachyzoites compared with their subpopulations. In infections with bradyzoites was observed that total and PS+ populations showed no significant differences, while the PS- was significantly lower. Regarding the development of cystogenesis, infection with tachyzoites did not generate the formation of tissue cysts while bradyzoites, total population and PS+ were capable of inducing high cystogenesis compared to population PS-. These data show the involvement of PS exposure in infections with T. gondii and its intracellular fate, showing that exposure of PS is an important factor favoring the spontaneous encystment in skeletal muscle cells when the cell cultures were infected with bradyzoites.

A cinética enzimática dos derivados de quinizarina com cadeias homólogas por lipases imobilizadas foi investigada por espectroscopia de fluorescência. Este estudo foi realizado em nível macroscópico e microscópico. Para o estudo macroscópico, foi utilizada a lipase suportada CALB (Novozyme® 435) e para o estudo microscópico a lipase Rhizopus niveus imobilizada em nanopartículas de sílica. Os derivados de quinizarina são espécies que não apresentam fluorescência, porém, quando são hidrolisados, tornam-se fluorescentes (quinizarina). Com um modelo cinético considerando um mecanismo de dois processos sequenciais do tipo Michaelis-Menten, foi possível fazer uma descrição adequada da evolução temporal da formação da quinizarina. O tempo médio de reação da hidrólise enzimática, em nível macroscópico, foi determinado para os derivados diacetato, dibutirato, dihexanoato e dioctanoato de quinizarina nos solventes hexano, ciclo-hexano e decalina saturados com água. No estudo microscópico, a lipase de Rhizopus niveus foi incorporada em nanopartículas de sílica de 200nm. A hidrólise enzimática foi monitorada por imagens e pela flutuação da intensidade de fluorescência com o tempo, por meio da microscopia de fluorescência confocal. Os resultados mostraram que, após a adição do substrato (derivados da quinizarina), começam a aparecer regiões fluorescentes devido ao trabalho enzimático (formação da quinizarina). As imagens de microscopia de fluorescência confocal não mostraram uma nítida diferença entre os substratos avaliados. Entretanto, o estudo da flutuação da intensidade de fluorescência mostrou que há uma diferença entre os substratos e que é possível estimar constantes de tempo de relaxação da atividade enzimática. Além disso, a atividade da lipase depende da forma em que a mesma está distribuída nas nanopartículas (ligada ou adsorvida) e também do tamanho da cadeia de alquílica que compões os derivados. O decaimento de fluorescência da quinizarina produzida pela hidrólise dos derivados pela lipase foi adquirido por microscopia de fluorescência confocal usando excitação de 2-fótons. / The kinetics of enzymatic hydrolysis of quinizarin diester by supported lipase dispersed beads in organic solvents was investigated by fluorescence spectroscopy. This study was performed on macroscopic and microscopic levels. For the macroscopic study was used CALB immobilized lipase (Novozyme ® 435) on acrylate beads, and for microscopic study Rhizopus niveus lipase immobilized on silica nanoparticles. The quinizarin derivatives (substrates) are non-fluorescent species, and only the end product quinizarin has fluorescence. A kinetic model considering two sequential Michaelis-Menten mechanisms provides a suitable description of the time evolution of the quinizarin formation monitored by emission spectroscopy and photon counting measurements. The average reaction time of the enzymatic hydrolysis was determined for quinizarin diacetate, dibutirate, dihexanoate and dioctanoate in hexane, cyclohexane and decaline water saturated solvents. In the microscopic study, the Rhizopus niveus lipase was dispersed into and bound silica mesoporous 200nm particles. In both systems, dispersed silica nanoparticles and a small fraction of aggregates are found in thin film. The enzyme activity was monitored by images and fluctuations of fluorescence intensity over time using confocal fluorescence microscopy. The results showed that after addition of substrate fluorescent spots due to enzyme activity start to appear. Confocal fluorescence images showed no clear difference among substrates. However, the study of fluorescence intensity fluctuations showed that enzyme activity depends on the type of substrate and enzyme support. In addition, the lipase activity depends on the form in which it is distributed in the nanoparticles (bound or entrapped) and the size of the alkyl diester derivatives. The fluorescence decay of quinizarin produced by lipase hydrolysis of diester was measured by confocal fluorescence microscopy using 2-photon pulse excitation.

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2018-12-11T17:35:15Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Andre Assmann.pdf: 4986341 bytes, checksum: 7a618a74a9cd9fd887a2ad317c21334b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-12-11T17:35:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Andre Assmann.pdf: 4986341 bytes, checksum: 7a618a74a9cd9fd887a2ad317c21334b (MD5) Previous issue date: 2018-10-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Medidas de tensão residual por microscopia de fluorescência é uma técnica bem estabelecida, que utiliza os picos de fluorescência R1 e/ou R2 dos íons Cr+3 em Al2O3. Esses picos são sensíveis à distorção da rede e sua frequência muda se o cristal estiver sob tensão. Amostras sinterizadas de vidro borossilicato e de soda-cal com a adição de 10 vol.% Al2O3 foram produzidas por mistura dos pós de vidro e alumina, prensagem uniaxial e sinterização em alta temperatura. A morfologia e microestrutura da superfície foram caracterizadas por microscopias ótica e eletrônica de varredura. A porosidade obtida foi inferior a 2%. Foram realizados indentações com carga de 10 N Vickers e as tensões ao redor das indentações foram medidas por microscopia de fluorescência. As medidas de tensões residuais devido à diferença de expansão térmica entre a matriz de vidro e as partículas de Al2O3 foram de 163 MPa e -35 MPa para amostras sinterizadas de borossilicato e soda-cal, respectivamente, em concordância com o modelo de Hseuh & Becher. A função de convolução do feixe de luz incidente (PRF) foi ajustada aos dados de fluorescência levando em conta a interação do feixe de laser dentro da amostra e os efeitos de absorção, refração e espalhamento do feixe de luz incidente por partículas de alumina e por poros e também por gradientes de tensões ao redor de indentações. O deslocamento experimental de fluorescência em função da distância da borda da indentação foi comparado com o modelo de Yoffe e com a função PRF. Verificou-se que a intensidade experimental do campo de indentação é 10 vezes menor que o previsto pelo modelo de Yoffe mesmo levando em consideração a densificação do vidro embaixo do penetrador. As tensões residuais de indentações também foram medidas para o vidro soda-cal usando o modelo modificado de Zeng e Rowcliffe. Os perfis de tensão foram medidos em torno de indentações Vickers realizadas com cargas de 50 N e 100 N em temperaturas entre -196 °C e 400 °C. A intensidade do campo aumentou com a temperatura e isso pode ser explicado pela variação da razão / com a temperatura. Este trabalho contribui para a compreensão dos mecanismos responsáveis pelas tensões residuais causadas por indentação em vidros. / Residual stress measurements by fluorescence microscopy is a well-established technique which uses the R1 and/or R2 fluorescence peaks of Cr+3 ions in Al2O3. These peaks are sensitive to the distortion of the lattice and their position changes if the crystal is stressed. Borosilicate (BS) and soda-lime (SL) sintered samples with 10 vol. % Al2O3 were produced mixing the glass and alumina powders, uniaxial compressed and sintered at high temperature. Surface morphology and microstructure were characterized by optical and scanning electron microscopies. The porosity obtained was less than 2%. 10 N Vickers indentations were performed and the stresses around the indentations were measured by fluorescence microscopy. Measurements of residual stresses due to thermal expansion mismatch between the glass matrix and the Al2O3 were 163 MPa and -35 MPa for BS and SL composites samples, respectively, in agreement with Hseuh & Becher’s model. The probe response function was fitted to the fluorescence data taking into account the iteraction of the laser beam within the sample and effects of light absorption, refraction and scattering by alumina particles and pores and stresses gradients. The experimental fluorescence shift as a function of the distance from the indentations was compared with Yoffe’s model and the PRF function. It was found that the experimental blister field strength is a factor of 10 smaller than that predicted by Yoffe´s model, taking into account the densification of the glass underneath the indenter. Indentation residual stresses were also measured for SL glass using the Zeng and Rowcliffe’s model. Stress profiles were measured around 50 N and 100 N Vickers indentations performed between -196 °C to 400 °C. The blister field strength increased with temperature and it could be explained by the variation of the / ratio with temperature. This work contributes for the understanding of the mechanisms responsible for the indentation residual stresses in glasses.

A restauração de imagens obtidas através de microscopia de seccionamento óptico computacional, utilizando técnicas de fluorescência, é um problema relevante em muitas aplicações biológicas. Diversos métodos foram propostos nos últimos anos com diferentes graus de sucesso para melhorar a qualidade destas imagens, mas a complexidade dos dados e o custo computacional do processamento ainda permanecem como fatores limitantes neste tipo de problema. Consideramos, neste trabalho, várias metodologias para a deconvolução de imagens tridimensionais obtidas em microscopia de fluorescência wide-field, onde propomos métodos lineares não iterativos e também algoritmos iterativos não lineares, que incorporam a presença do ruído Poisson nas observações devido à baixa contagem de fótons. Ainda, propomos duas abordagens específicas para a redução do ruído Poisson, sendo a primeira baseada em um critério de máximo a posteriori e a segunda na transformação de Anscombe. O primeiro algoritmo de deconvolução linear não iterativo é um método de dois passos baseado em um filtro de restauração não linear derivado a partir de um critério de máximo a posteriori, que considera uma distribuição de Poisson para modelar o ruído presente na imagem observada. O segundo, é um filtro de mínimo erro médio quadrático derivado usando o princípio da ortogonalidade no domínio de Fourier a partir de um modelo para o ruído Poisson. Os métodos iterativos não lineares são baseados na teoria de Projeções sobre Conjuntos Convexos, sendo que propomos o uso de cinco conjuntos de restrições convexas. Estas restrições são derivadas de forma a deconvoluir a imagem observada com a função de espalhamento pontual do microscópio, recuperar parte das freqüências perdidas devido à função de transferência óptica do sistema, garantir a positividade da solução e, também, prevenir erros introduzidos pelo processo de regularização. Os algoritmos foram analisados utilizando imagens sintéticas, com diferentes níveis de ruído Poisson e com imagens de espécimes reais. Os métodos também foram comparados com os algoritmos Maximum Likelihood Expectation Maximization e Regularized Linear Least Squares, apresentando boa performance em termos visuais e também uma boa relação custo-benefício. Ainda, propomos uma metodologia eficiente para a esqueletização tridimensional de estruturas tubulares, como neurônios e artérias, através do cálculo numérico de campos vetoriais e da estimação de curvaturas principais usando o mapa de Weingarten. Dada uma imagem binária, o método consiste em gerar uma imagem em tons de cinza, correspondente à magnitude de um campo de vetores, seguido por uma busca de pontos que pertencem aos vales de potenciais. Pode-se mostrar que estes pontos correspondem à transformação do eixo médio. Apresentamos resultados para contornos bidimensionais e também para imagens tridimensionais de neurônios e artérias. O algoritmo demonstrou uma boa performance, uma vez que o campo vetorial pode ser rapidamente calculado usando algoritmos de transformada rápida de Fourier / The deconvolution of images obtained by means of optical-sectioning widefield fluorescence rnicroscopy, is a relevant problem in biological applications. Several methods have been proposed in the last few years, with different degrees of success, to improve the quality of the images, but the data complexity and the computational cost remain a limiting factor in this problem. We present in this work several methodologies to perform the deconvolution of three-dimensional data obtained by wide-field fluorescence microscopy. We present both linear, non-iterative and non-linear, iterative methods that take into accont the nature of the noise due to the low leve1 of photon counts. We also propose two algoritms to reduce the Poisson noise. The first one is based on a maximum a posteriori approach and the second one is based on the Anscombe transformation. The first linear, non-iterative algorithm is a two-pass method based on a nonlinear maximum a posteriori restoration filter derived using the Poisson noise model. The second linear, non-iterative deconvolution algorithm is a pointwise, space invariant, minimum mean square restoration filter for the Poisson image noise model derived using the orthogonality principle in the Fourier domain. The non-linear, iterative methods are based on the Projection onto Convex Sets theory. In the restoration algorithms, we combine five constraints sets in order to restore the out-of-focus blur, to retrieve the missing frequencies due to the transfer function of the optical system, to guarantee positiveness, and also to prevent the regularization errors. The methods were analysed using phantoms with several degrees of Poisson noise and with real ceil images. Also, they were compared with the Maximum Likelihood Expectation Maximization and Regularized Linear Least Squares algorithms. All the metodologies demonstrate good performance in terms of both visual results and cost-benefit analysis. We also propose an approach for efficient three-dimensional skeletonization of tubular structures, such as neurons and arteries, through fast numerical calculation of vector fields and curvature estimation by using the Weingarten formulae. In short, given a binary image, the method consists in generating a grayscale image corresponding to the magnitude of a vector field followed by a search of the points that belong to the botton of the potencial valleys. It can be shown that these points correspond to the media1 axis transformation. We present results for both two-dimensional shapes and three-dimensional arteries and neurons images. The algorithm has demonstrated a good performance due to the fact that the vector field can be easy and fastly calculated using the fast Fourier transform algorithm

A restauração de imagens obtidas através de microscopia de seccionamento óptico computacional, utilizando técnicas de fluorescência, é um problema relevante em muitas aplicações biológicas. Diversos métodos foram propostos nos últimos anos com diferentes graus de sucesso para melhorar a qualidade destas imagens, mas a complexidade dos dados e o custo computacional do processamento ainda permanecem como fatores limitantes neste tipo de problema. Consideramos, neste trabalho, várias metodologias para a deconvolução de imagens tridimensionais obtidas em microscopia de fluorescência wide-field, onde propomos métodos lineares não iterativos e também algoritmos iterativos não lineares, que incorporam a presença do ruído Poisson nas observações devido à baixa contagem de fótons. Ainda, propomos duas abordagens específicas para a redução do ruído Poisson, sendo a primeira baseada em um critério de máximo a posteriori e a segunda na transformação de Anscombe. O primeiro algoritmo de deconvolução linear não iterativo é um método de dois passos baseado em um filtro de restauração não linear derivado a partir de um critério de máximo a posteriori, que considera uma distribuição de Poisson para modelar o ruído presente na imagem observada. O segundo, é um filtro de mínimo erro médio quadrático derivado usando o princípio da ortogonalidade no domínio de Fourier a partir de um modelo para o ruído Poisson. Os métodos iterativos não lineares são baseados na teoria de Projeções sobre Conjuntos Convexos, sendo que propomos o uso de cinco conjuntos de restrições convexas. Estas restrições são derivadas de forma a deconvoluir a imagem observada com a função de espalhamento pontual do microscópio, recuperar parte das freqüências perdidas devido à função de transferência óptica do sistema, garantir a positividade da solução e, também, prevenir erros introduzidos pelo processo de regularização. Os algoritmos foram analisados utilizando imagens sintéticas, com diferentes níveis de ruído Poisson e com imagens de espécimes reais. Os métodos também foram comparados com os algoritmos Maximum Likelihood Expectation Maximization e Regularized Linear Least Squares, apresentando boa performance em termos visuais e também uma boa relação custo-benefício. Ainda, propomos uma metodologia eficiente para a esqueletização tridimensional de estruturas tubulares, como neurônios e artérias, através do cálculo numérico de campos vetoriais e da estimação de curvaturas principais usando o mapa de Weingarten. Dada uma imagem binária, o método consiste em gerar uma imagem em tons de cinza, correspondente à magnitude de um campo de vetores, seguido por uma busca de pontos que pertencem aos vales de potenciais. Pode-se mostrar que estes pontos correspondem à transformação do eixo médio. Apresentamos resultados para contornos bidimensionais e também para imagens tridimensionais de neurônios e artérias. O algoritmo demonstrou uma boa performance, uma vez que o campo vetorial pode ser rapidamente calculado usando algoritmos de transformada rápida de Fourier / The deconvolution of images obtained by means of optical-sectioning widefield fluorescence rnicroscopy, is a relevant problem in biological applications. Several methods have been proposed in the last few years, with different degrees of success, to improve the quality of the images, but the data complexity and the computational cost remain a limiting factor in this problem. We present in this work several methodologies to perform the deconvolution of three-dimensional data obtained by wide-field fluorescence microscopy. We present both linear, non-iterative and non-linear, iterative methods that take into accont the nature of the noise due to the low leve1 of photon counts. We also propose two algoritms to reduce the Poisson noise. The first one is based on a maximum a posteriori approach and the second one is based on the Anscombe transformation. The first linear, non-iterative algorithm is a two-pass method based on a nonlinear maximum a posteriori restoration filter derived using the Poisson noise model. The second linear, non-iterative deconvolution algorithm is a pointwise, space invariant, minimum mean square restoration filter for the Poisson image noise model derived using the orthogonality principle in the Fourier domain. The non-linear, iterative methods are based on the Projection onto Convex Sets theory. In the restoration algorithms, we combine five constraints sets in order to restore the out-of-focus blur, to retrieve the missing frequencies due to the transfer function of the optical system, to guarantee positiveness, and also to prevent the regularization errors. The methods were analysed using phantoms with several degrees of Poisson noise and with real ceil images. Also, they were compared with the Maximum Likelihood Expectation Maximization and Regularized Linear Least Squares algorithms. All the metodologies demonstrate good performance in terms of both visual results and cost-benefit analysis. We also propose an approach for efficient three-dimensional skeletonization of tubular structures, such as neurons and arteries, through fast numerical calculation of vector fields and curvature estimation by using the Weingarten formulae. In short, given a binary image, the method consists in generating a grayscale image corresponding to the magnitude of a vector field followed by a search of the points that belong to the botton of the potencial valleys. It can be shown that these points correspond to the media1 axis transformation. We present results for both two-dimensional shapes and three-dimensional arteries and neurons images. The algorithm has demonstrated a good performance due to the fact that the vector field can be easy and fastly calculated using the fast Fourier transform algorithm

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2365.pdf: 3383262 bytes, checksum: 5fa930c4afb4d585bb6d96947f2cc22f (MD5) Previous issue date: 2008-09-26 / Financiadora de Estudos e Projetos / The study of living cells, isolated or in tissues, in several applications, requires the use of microscopy techniques. The fluorescence microscopes are specially important for making possible images with enhancement of specific structures and detection of biological processes. However, microscopes, like other optical systems, corrupt images so that many details are lost after the passage of the image through their optical components. The conventional (wide-field) fluorescence microscopes degrade images mainly on the axial direction, limiting the amount of frequencies that passes through the system. As a result, there is an out-of-focus blur, making it difficult to use the images to obtain three-dimensional (3D) images by computational optical sectioning microscopy (COSM). The main contribution of this thesis is the development of computer-based methods that are able to restore acquired images, through spectrum extrapolation algorithms that restore a portion of the lost frequencies, even in noisy images. A non-linear algorithm was proposed, based on the Richardson-Lucy method, with space and frequency domain constraints as in the Gerchberg-Papoulis algorithm. this method defines an unified algorithm to restore and extrapolate images, focusing on the spatial finite support constraint. The proposed method showed improved extrapolation when compared to previously known methods. Besides, other algorithms were developed based on the proposed method. Each variation of the basic algorithm has distinct features to attenuate the noise, define adaptively the spatial constraint, and detect the image background region. The use of an adaptive constraint and the extraction of information directly from the images were shown to contribute to the recovery of lost frequencies. The results are promising, showing the potential of extrapolation in real conditions, improving the three-dimensional visualization of specimens in wide-field (non-confocal) microscopes, helping many important applications in biotechnology, such as the assessment of cell cultures. / O estudo de células, isoladas ou na forma de tecidos, em diversas aplicações biotecnológicas requer a utilização de técnicas de microscopia. O microscópio de fluorescência, em especial, é atualmente uma ferramenta de grande importância por permitir destacar detalhes em células e detectar processos biológicos. Contudo, os microscópios, como outros sistemas óticos, corrompem as imagens de forma que muitos detalhes são perdidos na passagem da imagem pelos componentes óticos deste tipo de equipamento. Os microscópios de fluorescência convencionais degradam a imagem principalmente na direção axial, o que, no domínio da frequência, é visto como um limite de banda nesta direção que inviabiliza a visualização de imagens tridimensionais por microscopia de seccionamento ótico computacional. A principal contribuição deste projeto é o desenvolvimento de métodos computacionais que restaurem estas imagens mediante a utilização de algoritmos de extrapolação que recuperem parte das frequências perdidas além do limite de banda do microscópio, mesmo na presença de ruído. Para tal fim, foi proposto um procedimento não linear com base no algoritmo Richardson-Lucy, com restrições no domínio do espaço e da frequência, conforme o algoritmo de Gerchberg-Papoulis. O método proposto define um algoritmo único para restauração e extrapolação, com foco na restrição de suporte finito espacial. Este método mostrou melhoria na extrapolação quando comparado à metodos conhecidos na literatura. Foram desenvolvidas variantes deste algoritmo, cada qual possuindo características para atenuar o ruído, calcular de forma adaptativa a restrição espacial, e detectar a região de fundo da imagem. Foi mostrado que o uso de restrições adaptativas e a extração de informações a partir da imagem pode contribuir para a recuperação de frequências perdidas. Os resultados obtidos são promissores, pois mostram o potencial de extrapolação dos métodos em condições reais, permitindo a melhoria na visualização tridimensional de espécimes em microscópios wide-field (não-confocais), auxiliando diversas aplicações importantes em biotecnologia, como no caso de acompanhamento de cultivos celulares.

A cinética enzimática dos derivados de quinizarina com cadeias homólogas por lipases imobilizadas foi investigada por espectroscopia de fluorescência. Este estudo foi realizado em nível macroscópico e microscópico. Para o estudo macroscópico, foi utilizada a lipase suportada CALB (Novozyme® 435) e para o estudo microscópico a lipase Rhizopus niveus imobilizada em nanopartículas de sílica. Os derivados de quinizarina são espécies que não apresentam fluorescência, porém, quando são hidrolisados, tornam-se fluorescentes (quinizarina). Com um modelo cinético considerando um mecanismo de dois processos sequenciais do tipo Michaelis-Menten, foi possível fazer uma descrição adequada da evolução temporal da formação da quinizarina. O tempo médio de reação da hidrólise enzimática, em nível macroscópico, foi determinado para os derivados diacetato, dibutirato, dihexanoato e dioctanoato de quinizarina nos solventes hexano, ciclo-hexano e decalina saturados com água. No estudo microscópico, a lipase de Rhizopus niveus foi incorporada em nanopartículas de sílica de 200nm. A hidrólise enzimática foi monitorada por imagens e pela flutuação da intensidade de fluorescência com o tempo, por meio da microscopia de fluorescência confocal. Os resultados mostraram que, após a adição do substrato (derivados da quinizarina), começam a aparecer regiões fluorescentes devido ao trabalho enzimático (formação da quinizarina). As imagens de microscopia de fluorescência confocal não mostraram uma nítida diferença entre os substratos avaliados. Entretanto, o estudo da flutuação da intensidade de fluorescência mostrou que há uma diferença entre os substratos e que é possível estimar constantes de tempo de relaxação da atividade enzimática. Além disso, a atividade da lipase depende da forma em que a mesma está distribuída nas nanopartículas (ligada ou adsorvida) e também do tamanho da cadeia de alquílica que compões os derivados. O decaimento de fluorescência da quinizarina produzida pela hidrólise dos derivados pela lipase foi adquirido por microscopia de fluorescência confocal usando excitação de 2-fótons. / The kinetics of enzymatic hydrolysis of quinizarin diester by supported lipase dispersed beads in organic solvents was investigated by fluorescence spectroscopy. This study was performed on macroscopic and microscopic levels. For the macroscopic study was used CALB immobilized lipase (Novozyme ® 435) on acrylate beads, and for microscopic study Rhizopus niveus lipase immobilized on silica nanoparticles. The quinizarin derivatives (substrates) are non-fluorescent species, and only the end product quinizarin has fluorescence. A kinetic model considering two sequential Michaelis-Menten mechanisms provides a suitable description of the time evolution of the quinizarin formation monitored by emission spectroscopy and photon counting measurements. The average reaction time of the enzymatic hydrolysis was determined for quinizarin diacetate, dibutirate, dihexanoate and dioctanoate in hexane, cyclohexane and decaline water saturated solvents. In the microscopic study, the Rhizopus niveus lipase was dispersed into and bound silica mesoporous 200nm particles. In both systems, dispersed silica nanoparticles and a small fraction of aggregates are found in thin film. The enzyme activity was monitored by images and fluctuations of fluorescence intensity over time using confocal fluorescence microscopy. The results showed that after addition of substrate fluorescent spots due to enzyme activity start to appear. Confocal fluorescence images showed no clear difference among substrates. However, the study of fluorescence intensity fluctuations showed that enzyme activity depends on the type of substrate and enzyme support. In addition, the lipase activity depends on the form in which it is distributed in the nanoparticles (bound or entrapped) and the size of the alkyl diester derivatives. The fluorescence decay of quinizarin produced by lipase hydrolysis of diester was measured by confocal fluorescence microscopy using 2-photon pulse excitation.