Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências de Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia / Made available in DSpace on 2013-07-16T00:39:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 221571.pdf: 1747630 bytes, checksum: 95f6bd779e011abb44f7b39b6e8e3c67 (MD5) / A avaliação dos níveis de apoptose por citometria de fluxo é geralmente realizada por métodos que utilizam anexina V-FITC como marcador vital, que se associa aos resíduos de fosfatidilserina, externalizados no início do processo apoptótico. A utilização conjunta do marcador nuclear fluorescente iodeto de propídio (PI), por sua vez, torna possível verificar as alterações nucleares características dos estágios tardios da apoptose, como resultado do aumento da permeabilidade de membrana. Por outro lado, a utilização de calceína AM e homodímero de etídio (EthD-1) permite a verificação da apoptose através da detecção da diminuição de atividade esterásica intracelular e alterações físico-químicas na membrana celular, através do EthD-1, que combina-se à cromatina à medida que esta se torna condensada. O objetivo deste trabalho foi avaliar e comparar a sensibilidade na avaliação precoce da apoptose dos métodos que utilizam calceína AM e homodímero de etídio aqueles que utilizam anexina V FITC e iodeto de propídio, tomado como método de referência, a partir da marcação de células mononucleares periféricas de pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência adquirida (HIV). As análises por citometria de fluxo foram realizadas após os períodos de incubação de 24 e 48 horas em meio RPMI 1640. Os resultados demonstraram que a metodologia que utiliza calceína AM/ homodímero de etídio apresentou-se mais sensível na quantificação das células apoptóticas em ambos períodos de incubação (Média 46,95% ± 3,56, p<0,0001, para 24 horas e Média 37,67% ± 2,47, p<0,0014 para 48 horas), além de permitir definir com clareza as populações de células viáveis, em apoptose e inviáveis. Tendo em vista que a regulação anormal do processo de morte celular por apoptose está envolvida na patogênese de diversas desordens, incluindo a progressão da infecção pelo HIV, o emprego de metodologias sensíveis de avaliação desse processo, como a calceína AM-EthD-1, pode resultar em importante mecanismo de acompanhamento da progressão de doenças.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:40:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 rafael_soares_ioc_mest_2014.pdf: 9999442 bytes, checksum: ac5e27ea1a79926391d54c0c9862a009 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A fosfatidilserina (PS) é conhecida por seu papel na regulação da apoptose e interferir em várias vias de sinalização celular. Por meio da exposição da PS, as células apoptóticas são internalizadas de forma eficiente por fagócitos, prevenindo uma resposta inflamatória. Assim, durante a evolução, alguns protozoários se utilizaram do processo chamado de \201Cmimetismo apoptótico\201D para a evasão do sistema imune do hospedeiro. O Toxoplasma gondii é um protozoário parasito intracelular obrigatório e agente etiológico da toxoplasmose. Em taquizoítos de T. gondii da cepa RH, cepa do tipo I, virulenta, cerca de 50% dos parasitos expressam PS na sua superfície. No presente trabalho foram empregadas formas bradizoítas e taquizoítas de cepa ME49, a fim de elucidar a participação das subpopulações de T. gondii, PS positivas e negativas, na infecção de células musculares esqueléticas e seu papel no desenvolvimento da cistogênese, in vitro. Para essas análises os parasitos (cistos, taquizoítos e bradizoítos) incubados com anexina-FITIC foram analisados por técnicas de citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. A parede cística e o interior dos cistos teciduais de T. gondii foram positivos para anexina, enquanto os taquizoítos e bradizoítos apresentaram subpopulações que expõem ou não PS em sua membrana A infecção de células hospedeiras por essas subpopulações de parasitos foi testada e quantificada em culturas de células musculares esqueléticas. As infecções e proliferação dos parasitos foram maiores na população total de taquizoítos em comparação com as suas subpopulações. Em infecções com bradizoítos utilizando população total e PS+ não se observou diferenças significativas, enquanto a infecção da subpopulação PS- foi significantemente menor. Quanto ao desenvolvimento da cistogênese, a infecção com taquizoítos não gerou a formação de cistos teciduais, enquanto células infectadas com bradizoítos da população total e da PS+ foram capazes de alta indução da cistogênese comparada à população PS-. Esses dados evidenciam a participação da exposição de PS em infecções pelo T. gondii e seu destino intracelular, mostrando que a exposição de PS é um fator importante que favorece o encistamento espontâneo em células musculares esqueléticas quando as culturas foram infectadas com bradizoítos / Phosphatidylserine (PS) is known for its role in regulating apoptosis and interferes with several cellular signaling pathways. Apoptotic cells, which exposure PS, are internalized efficiently by phagocytes, preventing an inflammatory response. Thus, during evolution, some protozoa use the process called "apoptotic mimicry" for evasion of the host immune system. Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite and the causative agent of toxoplasmosis. In tachyzoites of T. gondii RH strain, type I virulent, about 50% of the parasites have PS on their surface. In the present work bradyzoites and tachyzoites forms of ME49 strain, type II avirulent, were employed in order to elucidate the involvement of subpopulations of T. gondii expressing positive and negative PS, during infection of skeletal muscle cells and its role in the development of cystogenesis, in vitro. For these assays, parasites (cysts, tachyzoites and bradyzoites) were incubated with annexin-FITIC and analyzed by flow cytometry and fluorescence microscopy. Cyst wall and the matrix of tissue cysts were positive for annexin, while tachyzoites and bradyzoites showed subpopulations exposing or not PS on their surface. The able of infection and proliferation of parasites were highest in the total population of tachyzoites compared with their subpopulations. In infections with bradyzoites was observed that total and PS+ populations showed no significant differences, while the PS- was significantly lower. Regarding the development of cystogenesis, infection with tachyzoites did not generate the formation of tissue cysts while bradyzoites, total population and PS+ were capable of inducing high cystogenesis compared to population PS-. These data show the involvement of PS exposure in infections with T. gondii and its intracellular fate, showing that exposure of PS is an important factor favoring the spontaneous encystment in skeletal muscle cells when the cell cultures were infected with bradyzoites.