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Avaliação do modelo de status epilepticus por ouabaína: da administração intracerebroventricular à análise de parâmetros comportamentais e indicadores de dano cerebral / Evaluating the Ouabain-induced model of Status epilepticus: From intracerebroventricular route to analysis of behavioral and brain damage parametersLustosa, Ítalo Rosal 07 December 2016 (has links)
LUSTOSA, I. R. Avaliação do modelo de status epilepticus por ouabaína: da administração intracerebroventricular à análise de parâmetros comportamentais e indicadores de dano cerebral. 2016. 118 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-03-20T13:47:59Z
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Previous issue date: 2016-12-07 / Status epilepticus (SE) is a common and potentially lethal form of clinical emergency. The advances in antiepileptic therapy in the last decades failed to change the rates of treatment responsiveness in that condition, as well as in epilepsies. Down regulation of Na +, K + -ATPase (NKA) activity has been implicated in the pathophysiology of various neurodegenerative diseases, including epilepsy. In the present study, epileptic seizures were induced through intracerebroventricular (i.c.v.) ouabain, a model with predictive value for generalized tonic-clonic seizures. The ethological characteristics of the seizures were outlined regarding the localizing semiology. Neurochemical analysis were also performed: lipoperoxidation, TBARS; reduced glutathione (GSH) concentration; and nitrite (NO2-) concentration in prefrontal cortex (F), hippocampus (H), striatum (E), thalamus (T) and mesencephalon (M). About ~ 85% of the animals receiving 29.23 μg of i.c.v. ouabain exhibited a behavior consisting of two procursive seizures intercalated by freezing and followed by partial clonus evolving as generalized clonus with loss of the righting reflex and late tonus. This pattern is highly suggestive of primary multifocal ictogenesis in limbic (H) and brainstem (lower colliculus) areas followed by secondary generalization. Lipoperoxidation was significantly increased in relation to control in all studied areas: F, E and H (p <0.0001); T (p <0.001); M (p <0.01). GSH concentration was significantly reduced only in F (p <0.01) and E (p <0.0001). NO2- concentration was increased in T and M (p <0.01); Values of p <0.05 were considered significant. Neurochemistry evidences severe oxidative damage, mainly in lipid membranes. The increase in NO2- in caudal structures corroborates with literature about the audiogenic model. A hypothesis that may aggregate pathomechanistic relevance to the model as theoretical construct is thrown. Furthermore, the implementation of an i.c.v administration protocol offers ample possibilities for the research and drug development. / O status epilepticus (SE) é uma forma comum de emergência clínica potencialmente letal. O avanço na terapia antiepiléptica nas últimas décadas não modificou as taxas de responsividade a tratamento desta condição, bem como das epilepsias em geral. A regulação para baixo da tividade de Na+,K+-ATPase (NKA) tem sido implicada na fisiopatologia de diversas doenças neurodegenerativas, inclusive epilepsias. No presente trabalho, foram induzidas crises epilépticas por ouabaína via intracerebroventricular (i.c.v.), um modelo com valor preditivo para crises tônico-clônias generalizadas. Foram delineadas as características etológicas do SE com vistas à semiologia de valor localizatório e mediram-se indicadores neuroquímicos: lipoperoxidação, TBARS; concentração de glutationa, GSH; nitrito, NO2- nas áreas cerebrais córtex pré-frontal (F), hipocampo (H), corpo estriado (E), tálamo (T) e mesencéfalo (M). Cerca de ~85% dos animais que recebem 29,23 µg de ouabaína via i.c.v. exibiram um comportamento consistente de duas crises procursivas intercaladas por freezing seguidas de clono parcial que evolui com clono generalizado e perda do reflexo de endireitamento com fenômenos tônicos tardios. Este padrão é altamente sugestivo de ictogênese primária multifocal em áreas límbica (H) e de tronco encefálico (colículo inferior) seguidas de generalização. A lipoperoxidação esteve significativamente aumentada em relação ao controle em todas as áreas estudadas: F, E e H (p<0,0001); T (p<0,001); M (p<0,01). A [GSH] esteve significativamente reduzida apenas em F (p<0,01) e E (p<0,0001). A [NO2-] esteve aumentada em T e M (p<0,01). Valores de p<0,05 foram considerados significativos. A neuroquímica evidencia grave dano oxidativo, nomeadamente nas membranas lipídicas. O aumento da [NO2-] em estruturas caudais corrobora com a literatura sobre o modelo audiogênico. Fornece-se ainda uma hipótese sobre a fisiopatologia do modelo da ouabaína i.c.v. que pode agregar-lhe relevância patomecanística enquanto construto teórico. Ademais, aportam-se amplas possibilidades para a pesquisa e desenvolvimentos de medicamentos através da implantação do protocolo de via de administração i.c.v. crônica.
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Silenciamento gênico de TGF-β1 e determinantes precoces de área de infarto em modelo experimentalVietta, Giovanna Grünewald January 2012 (has links)
Resumo não disponível
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Avaliação espectrofotométrica de reação inflamatória corneanaGehlen, Marcelo Luiz 02 January 2013 (has links)
Resumo: Introdução: o azul de Evans constitui-se num corante inócuo que tem alta afinidade pela albumina e pode ser mensurado espectrofotometricamente como demonstram vários estudos. Objetivos: a) Constatar a presença do azul de Evans na córnea normal estipulando o período de tempo de concentração máxima do corante após inoculação endovenosa; b) Verificar o mecanismo de difusão do corante no tecido; c) Mensurar a exsudação do azul de Evans em processo inflamatório após indução de queimadura química corneana com NaOH. Material e métodos: Utilizou-se 50 coelhos albinos machos que foram divididos em 3 grupos: Grupo I: composto de 25 animais e que inoculou-se via endovenosa 20 mg/Kg de azul de Evans e sacrificou-se os animais em 8, 10, 12, 14 e 16 horas após injeção do corante. A partir de então extraiu-se o tecido corneano margeado por 1 mm de esclera e quantificou-se o corante através do micrométodo espectrofotométrico. Grupo II: Em 15 animais inoculou-se o corante via endovenosa e posteriormente fragmentou-se centralmente o tecido com trépanos de 6, 8 e 10 mm e procedeu-se a extração do azul de Evans da mesma forma que no grupo I. Grupo III: induziu-se queimadura na córnea do olho direito de 10 animais com NaOH a 1 N. Cinco dias após o procedimento, os animais foram sacrificados, sendo que, 10 horas antes do sacrifício, foi inoculado o azul de Evans para que posteriormente se pudesse quantificá-lo. A córnea esquerda serviu como controle. Resultados: no grupo I, as médias das concentrações do azul de Evans foram: 8 h.: 14,68 ?g/mg; 10 h.: 15,30 ?g/mg; 12 h.: 15,02 ?g/mg; 14 h.: 14,09 ?g/mg; 16 h.: 14,85 ?g/mg. No grupo II, as médias das concentrações do corante foram: 6 mm.: 0,93 ?g/g; 8 mm.: 1,19 ?g/mg; 10 mm.: 1,35 ?g/mg. No grupo III, as médias das concentrações do azul de Evans foram: olho direito (queimadura): 23,74 ?g/mg e olho esquerdo (controle): 16,71 ?g/mg. Discussão e Conclusão: O azul de Evans tem sido motivo de estudo em diversos órgãos e em diferentes animais. Foi possível quantificar pela primeira vez o corante na córnea de coelhos e constatar que, após 10 horas de inoculação endovenosa, o azul de Evans atingiu seu pico de concentração no tecido. As concentrações do corante decresceram a medida que se atingia porções mais centrais da córnea como foi demonstrado no grupo II, revelando um padrão de distribuição centrípeta do corante no tecido estudado. Comprovou-se que o aumento da permeabilidade vascular, induzida pela queimadura química na córnea, está diretamente ligada ao extravazamento do corante ao tecido, aumentando significativamente (p<0,001) sua concentração em relação à córnea normal. Portanto, o azul de Evans serve como um bom método de quantificação da permeabilidade vascular alterada na córnea, especialmente na vigência de processo inflamatório.
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Nova proposta de modelo murino de asma aguda: utilização de protocolo curto sem adjuvante com sensibilização a ovalbuminaRodrigues, Andréa Mendonça January 2011 (has links)
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Previous issue date: 2011 / Introduction: Some limitations have been raised over the murine models with ovalbumin (OVA) sensitization in asthma research. However, this model is still widely used and the acute OVA protocol in mice still plays a role in pre-clinical investigation. The use of adjuvant and long sensitization periods are some of the limitations raised. Aims: We have tested whether a shorter period of subcutaneous sensitization with OVA, with no adjuvant, induces a similar eosinophilic pulmonary response in mice, when compared with previous well-established control protocols. Methods: Adult female BALB/c mice were used and divided into groups, according to the number of OVA sensitizations (once or twice, OVA: 20 μg) and the number (two or three times) /dosage(40 μg and 100 μg) of intranasal OVA challenge. The shorter protocol (10 days-length) consisted of one subcutaneous OVA sensitization and three OVA challenges (100 μg). Total (TCC) and differential cell counts from bronchoalveolar lavage (BAL), eosinophil peroxidase (EPO) from lung tissue and histopathology (HE) of the lungs were performed 24 hours after the last OVA challenge. Results: Cell counts from BAL, EPO from lung tissue and histological lung abnormalities were not different between the groups studied. The shorter protocol induced a similar allergic lung response to OVA, when compared with the positive control, the same occurring with the other groups. Conclusion: We concluded that the use of one subcutaneous OVA sensitization elicit a strong allergic pulmonary response, free of adjuvant, in a 10-day-length protocol. Our findings suggest that this protocol may be used a first-line pre-clinical test, reducing cost and time of experiments, and avoiding the use of artificial adjuvants. / Introdução: Várias limitações têm sido levantadas em estudos de asma utilizando modelos murinos agudos sensibilizados com ovalbumina (OVA), mas este modelo é ainda amplamente usado, ainda mantendo sua importância em estudos pré-clínicos. Algumas limitações encontradas são o uso de adjuvante e os longos períodos de sensibilização. Objetivos: Testar se a sensibilização com OVA em um período curto, sem adjuvante, induziria uma resposta pulmonar eosinofílica em camundongos similar aos protocolos já previamente estabelecidos.Métodos: Fêmeas adultas de camundongos BALB/c foram utilizadas e divididas em grupos de acordo com o número de sensibilizações com OVA (uma ou duas vezes, OVA: 20 μg) e o número(duas ou três vezes)/dosagem(40 μg e 100 μg) de desafios intranasais. O protocolo mais curto (10 dias) consistiu de uma sensibilização subcutânea e três desafios com OVA (100 μg). Contagem total (CTC) e diferencial de células no lavado broncoalveolar (LBA), ensaio da peroxidase eosinofílica (EPO) do tecido pulmonar e histopatologia (HE) dos pulmões foram realizados 24 horas após o último desafio com OVA. Resultados: Contagem celular do LBA, EPO do tecido pulmonar e alterações inflamatórias da histologia pulmonar não foram diferentes entre os grupos estudados. O protocolo mais curto induziu uma resposta eosinofílica pulmonar à OVA semelhante ao grupo controle, ocorrendo o mesmo com os outros grupos. Conclusão: O uso de sensibilização subcutânea com OVA, sem adjuvante, resulta em uma significativa resposta pulmonar alérgica, permitindo sua utilização em protocolos de duração mais curta. Nossos achados sugerem que este protocolo pode ser utilizado como teste pré-clínico de primeira linha para pesquisa de novos fármacos, reduzindo custo, tempo e uso de adjuvante.
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Silenciamento gênico de TGF-β1 e determinantes precoces de área de infarto em modelo experimentalVietta, Giovanna Grünewald January 2012 (has links)
Resumo não disponível
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Silenciamento gênico de TGF-β1 e determinantes precoces de área de infarto em modelo experimentalVietta, Giovanna Grünewald January 2012 (has links)
Resumo não disponível
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Transplante de células mononucleares de medula óssea em modelo lesional da doença de ParkinsonSilva, Caroline Calice da January 2011 (has links)
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Previous issue date: 2011 / Parkinson´s disease (PD) is characterized by a progressive loss of dopaminergic neurons from substantia nigra (SN), which leads to a deficiency of dopamine levels in the striatum. This deficiency is responsible by the development of motor symptoms like rest tremor, bradykinesia, rigidity and postural instability. Other alternatives to PD treatment have been studied and a promising possibility is the stem cell transplantation. The present study aims to assess the therapeutic potential of bone marrow-derived mononuclear cells (BMMC) transplantation in a mouse model of Parkinson´s disease. Animals underwent stereotaxic surgery and 6- hydroxydopamine (6-OHDA) was injected into their medial forebrain bundle (MFB). Three weeks later, they were transplanted with BMMCs, fibroblast or saline, through the caudal vein. Motor function was assessed using the Rotarod test and the apomorphine-induced rotation test. We had showed that BMMC, transplanted through caudal vein in parkinsonian mouse, are able to cross the BBB and migrate forward the encephalic tissue, besides survive until 1 week after transplantation. These cells, however, were not capable to restore the normal motor function of those animals, within 30 days post-transplantation. Whether BMMC could restore nigroestriatal dopaminergic neurons only to the histological level, and that restoration cannot be detected by motor test carried out, remains unclear. / A doença de Parkinson (DP) é caracterizada pela perda progressiva dos neurônios dopaminérgicos da substancia negra, a qual leva a uma deficiência de dopamina no estriado. Essa deficiência é responsável pelo desenvolvimento de sintomas motores como tremor em repouso, bradicinesia, rigidez e instabilidade postural. Novas alternativas para o tratamento da DP têm sido estudadas e uma possibilidade promissora é o transplante de células-tronco. O presente estudo visa avaliar o potencial terapêutico do transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO) em um modelo lesional da DP. Os animais foram submetidos à estereotaxia e 1μl de 6-hidroxidopamina foi injetado no feixe prosencefálico medial. Três semanas após, os camundongos foram transplantados com CMMO, fibroblasto ou salina, através da veia da cauda. A função motora foi avaliada através do teste de Rotarod e do teste de rotação induzida por apomorfina. Nosso estudo demonstrou que as CMMO, transplantadas através da veia da cauda em camundongos parkinsonianos, são capazes de atravessar a barreira hematoencefálica e migrar em direção ao tecido encefálico, além de sobreviverem por uma semana após o transplante. Essas células, porém, não foram capazes de restabelecer a função motora desses animais, em até 30 dias pós-transplante. Se as CMMO conseguiram restaurar os neurônios dopaminérgicos nigroestriatais apenas a nível histológico, não podendo essa restauração ser detectada pelos testes motores realizados, ainda precisa ser esclarecido.
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Avaliação da indiferenciação celular e indução de neurodiferenciação em co-cultivo de fibroblastos NIH 3T3 com células mononucleares do sangue de cordão umbilicalMarinowic, Daniel Rodrigo January 2011 (has links)
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Previous issue date: 2011 / Cellular therapy represent a new frontier for the treatment of several diseases, including diseases related to central nervous system. Human umbilical cord blood is an attractive source of stem cells; however, it has a heterogeneous population with a small amount of mesenchymal stem cells. Currently, cell reprogramming induced by different methodologies can confer pluripotency to differentiated adult cells. The objective of the study was to evaluate the reprogramming potential of fibroblasts and neural differentiation after co-culture with umbilical cord blood mononuclear cells. This study was approved by the Ethics Committee of PUCRS (CEP 11/05504). Cells were obtained from four human umbilical cord blood. Cell suspensions were fractionated at gradient of density 1077. The mononuclear cells of each sample were cultured for 7 days and later, the culture was infected with 105 cells of mouse fibroblast cell line NIH 3T3 and co-cultured for 6 days. To evaluate the pluripotency it was performed RNA extraction and later, amplification using primers specific for pluripotency genes. The differentiation was also confirmed by the adipogenic and osteogenic differentiation. Neural differentiation of the reprogrammed cells was obtained by the method described by Song et. al (2008) and evaluated by immunofluorescence. Population growth was quantified by hemocytometer. All co-cultured cells showed adipogenic and osteogenic differentiation capacity. After co-cultivation cells began transcribing the pluripotency gene KLF4. Statistically significant differences in the parameters area, diameter, optical density and fractal dimension were observed by confocal microscopy in reprogrammed and neural differentiated cells. The population of reprogrammed cells doubled every three days until the addition of the last medium of neural differentiation, when cultures became quiescent until the end of the neural differentiation. The contact in form of co-cultivation of fibroblasts with umbilical cord blood mononuclear fraction for six days promoted the reprogramming of these cells to a indifferentiation stage, allowing the induction of neural differentiation later. / As terapias celulares representam uma nova fronteira para o tratamento de diversas doenças, inclusive patologias relacionadas ao sistema nervoso central. O sangue de cordão umbilical humano é uma atrativa fonte de células-tronco, porém, apresenta uma população heterogênea com pouca quantidade de células-tronco mesenquimais. Atualmente, a reprogramação celular induzida através de metodologias distintas, pode conferir pluripotência às células adultas diferenciadas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de reprogramação de fibroblastos e a diferenciação neural após co-cultivo com fração mononuclear de sangue de cordão umbilical. Foram obtidas células da fração mononuclear de quatro cordões umbilicais humanos de pacientes atendidas no Centro Obstétrico do Hospital São Lucas da PUCRS. As suspensões celulares foram fracionadas em gradiente de densidade 1077. A fração mononuclear de cada amostra foi cultivada por sete dias e após, contaminada com 105 células da linhagem de fibroblasto de camundongos NIH 3T3 e co-cultivadas por 6 dias. Para avaliação da pluripotência, foi realizada extração de RNA e posterior amplificação utilizando oligonulceotídeos específicos para os genes de pluripotência Oct3/4, Sox2 e KLF4. O fenótipo mesenquimal foi confirmado pela diferenciação adipogênica e osteogênica. A neurodiferenciação das células reprogramadas seguiu o método descrito por Song et. al (2008) e foi avaliada por imunofluorescência. O crescimento populacional foi quantificado em hemocitômetro. Todas as células co-cultivadas mostraram capacidade de diferenciação adipogênica e osteogênica. Após o co-cultivo, as células passaram a transcrever o gene de pluripotência KLF4. Diferenças estatisticamente significativas nos parâmetros área, diâmetro, densidade óptica e dimensão fractal foram observadas por microscopia confocal nas células reprogramadas e neurodiferenciadas. A população de células reprogramadas duplicou a cada três dias até o momento da adição do ultimo meio de neurodiferenciação, quando as culturas tornaram-se quiescentes até o final do período de neurodifereciação. O contato em forma de co-cultivo dos fibroblastos com a fração mononuclear de cordão umbilical por seis dias promoveu a reprogramação dessas células a um estágio com certa plasticidade, permitindo a indução posterior de neurodiferenciação.
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Efeito da terapia com células mononucleares de medula óssea em perfurações agudas de membrana timpânicaFabricio, Daniela Dias January 2009 (has links)
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Previous issue date: 2009 / INTRODUCTION: Bone marrow mononuclear cells have been utilized in tissue regeneration attempts in several pathologies. The aim of this study was to evaluate the potential healing effect of these cells in fresh tympanic membrane perforations. METHODS: Bilateral myringotomy was performed in 10 Wistar rats. Bone marrow mononuclear cells were used in one side and physiologic solution (control) in the opposite side. We evaluated healing time, tympanic membrane mobility and histology. RESULTS: The side where mononuclear cells were applied healed 3 days earlier than the control side (p=0,006). There was no difference in mobility or histology between groups. CONCLUSION: Bone marrow mononuclear cells provided a faster tympanic membrane healing time when compared to a control group. / INTRODUÇÃO: As células mononucleares de medula óssea têm sido utilizadas em diversas patologias na tentativa de regeneração tecidual. O objetivo deste estudo foi avaliar o seu potencial efeito na cicatrização de perfurações agudas da membrana timpânica (MT). MÉTODOS: Foram realizadas perfurações timpânicas bilateralmente por meio de miringotomia em 10 ratos Wistar. Células mononucleares de medula óssea foram utilizadas de um lado e solução fisiológica no lado contralateral. Avaliou-se o tempo de cicatrização, a mobilidade timpânica e a histologia. RESULTADOS: O lado que utilizou células mononucleares cicatrizou em média 3 dias antes que o controle (p=0,006). Não houve diferença de mobilidade ou padrão histológico entre os grupos. CONCLUSÃO: As células mononucleares de medula óssea proporcionaram uma cicatrização mais rápida da MT que o grupo controle.
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Estudo de novos modelos experimentais em doença pulmonar alérgica em modelo murinoSchmidt, Camila Zanelatto Parreira January 2011 (has links)
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Previous issue date: 2011 / Introduction: Animal models studies of asthma have been criticized because of some limitations. Protocols with features and remote results of human asthma are widely used, mainly because of the need to use adjuvant and intraperitoneal administration of allergens for sensitization. Aims: We have tested alternative protocols using animal models of acute and chronic asthma, with features closer to human disease, using OVA without adjuvant. Methods: Adult female BALB/c mice were used and divided into groups according to sensitization with OVA. The acute model used two doses of OVA subcutaneously (s. c. ) without adjuvant, on days 0 and 7, and after intranasal (i. n. ) challenge for consecutives three days, compared with a standard protocol using three doses of OVA for sensitization. The chronic model also used OVA s. c. for sensitization, adjuvant-free, on days 0 and 14, and after i. n. challenge, 3 times a week, for consecutives eight weeks. Total (TCC) and differential cell counts from bronchoalveolar lavage (BAL) and histopathology of the lungs were performed 24 hours after the last OVA challenge. Results: In the two models of protocols studied, acute and chronic, we have observed similar allergic pulmonary response between the groups. Cell counts and histological analysis of lung tissue showed no significant difference between groups. Conclusion: the use of sensitization with OVA s. c., with no adjuvant, resulted in an expected allergic pulmonary response, with predominant eosinophils. These protocols may be a future option to animal models of asthma closer to the human disease, both in the acute and chronic patterns. / Introdução: estudos em modelos animais de asma têm sido criticados devido a algumas limitações. Protocolos com características e resultados distantes da asma em humanos são muito utilizados, principalmente devido à necessidade do uso de adjuvante e administração intraperitoneal do alergeno para sensibilização. Objetivo: testar alternativas de protocolos com modelos animais de asma aguda e crônica que apresentem características mais próximas da doença em humanos, utilizando OVA livre de adjuvante.Métodos: foram utilizadas fêmeas adultas de camundongos BALB/c, divididas em grupos de acordo com as sensibilizações com OVA. O modelo agudo utilizou duas doses de OVA subcutânea (s. c. ), sem adjuvante, com intervalo de 7 dias, com posterior desafio intranasal (i. n. ) durante 3 dias, comparado ao protocolo padrão que utiliza 3 doses de OVA intraperitoneal (i. p. ), no período de sensibilização. O modelo crônico também utilizou OVA s. c. livre de adjuvante para sensibilização, com intervalo de 14 dias e posterior desafio i. n., 3 vezes por semana, durante 8 semanas. Contagem total (CTC) e diferencial de células no lavado broncoalveolar (LBA) e análise histológica dos pulmões foram realizadas 24 horas após o último desafio com OVA. Resultados: nos dois modelos estudados, agudo e crônico, observamos uma resposta eosinofilica pulmonar semelhante entre os grupos. Contagem de células e análise histológica do tecido pulmonar não apresentaram diferença significativa entre os grupos estudados. Conclusão: o uso de sensibilização s. c. com OVA, sem adjuvante, resulta em uma significativa resposta inflamatória pulmonar alérgica, com predomínio de eosinófilos, podendo ser uma opção futura para experimentos mais próximos ao modelo humano, tanto na fase aguda, como na fase crônica da doença.
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