O primeiro passo para entender as funções da microbiota do trato digestivo na biologia dos insetos consiste na identificação dos membros destas comunidades. Neste trabalho, as bactérias presentes no mesêntero de lagartas da broca da cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis e da lagarta-do-cartucho-do-milho, Spodoptera frugiperda, provenientes de diferentes localidades, espécies ou variedades de plantas hospedeiras, foram identificadas por isolamentos em meio de cultura TSA (Triptona de Soja Agar) e por técnicas moleculares que independem do cultivo dos microrganismos. As lagartas de D. saccharalis foram coletadas em nove variedades de cana-deaçúcar nos municípios paulistas de Bocaina, Tanabi e Luís Antônio. S. frugiperda foram coletadas diretamente no campo em milho em Piracicaba-SP e populações de campo e de laboratório foram também alimentadas com dieta artificial, milho, algodão, sorgo e arroz. Foram utilizadas 90 lagartas de D. saccharalis e 40 de S. frugiperda sendo a microbiota de cada lagarta avaliada individualmente. As bactérias isoladas foram testadas quanto à capacidade de degradação de celulose, hemicelulose, lignina e bagaço de cana. A caracterização molecular foi realizada por DGGE (Gel de eletroforese em gradiente desnaturante) usando-se a região 16S do RNA ribossômico amplificado de DNA metagenômico extraído do mesêntero de 57 lagartas de D. saccharalis e 26 de S. frugiperda. Posteriormente, 6 destas amostras de DNA metagenômico de cada uma das espécies de insetos foram clonadas e as 12 bibliotecas de clones foram sequenciadas. A comunidade de bactérias cultiváveis das duas espécies de insetos é composta por representantes dos filos Firmicutes, Proteobacteria e Actinobacteria. A afiliação filogenética das seqüências das bibliotecas de clones de rRNA 16S revelou a ocorrência, além destes filos, de Bacteroidetes em D. saccharalis e Bacteroidetes e Acidobacteria em S. frugiperda. Somente bactérias isoladas de D. saccharalis apresentaram resposta positiva nos testes de degradação in vitro para celulose, hemicelulose, lignina e bagaço de cana. A capacidade destes microrganismos de degradar celulose foi maior do que hemicelulose e poucos produziram enzimas para degradar lignina. Somente duas bactérias apresentaram resposta positiva aos testes de degradação para todas estas fontes de carbono. As seqüências de rRNA 16S destas se agrupam com representantes de Phyllobacterium trifolii e Bacillus subtilis. O maior número de sequências de bactérias cultiváveis pertence aos gêneros Bacillus (26,4 e 32.4% em D. saccharalis e S. frugiperda, respectivamente), Enterococcus (12,1 e 13%) e Microbacterium (18 e 12%). As análises das seqüências obtidas do DNA metagenômico revelaram que Klebsiella esteve presente em todas as amostras analisadas de D. saccharalis. As comunidades de bactérias em S. frugiperda apresentaram maior variação em função do alimento. Entretanto, Ralstonia e Hydrogenophilus estiveram presentes na maioria das lagartas. As variações das estruturas das comunidades bacterianas de S. frugiperda e de D. saccharalis estão diretamente relacionadas com a origem das populações e o tipo de alimentação dos insetos. A presença constante de algumas bactérias na maioria dos insetos indica que estas possam ser indispensáveis, exercendo alguma função vital para o inseto ou que apresentam alguma relação vantajosa para o hospedeiro. / The identification of members of the microbe communities is the first step to understand their roles on insect biology. We have characterized the midgut bacterial community of fifth ínstar caterpillars of sugarcane borer, Diatraea saccharalis, and of fall armyworm, Spodoptera frugiperda, through isolation on tryptic soy agar medium and through culture-independent molecular techniques. D. saccharalis caterpillars were collected on nine sugarcane varieties in Bocaina, Tanabi and Luís Antônio cities in São Paulo State. S. frugiperda were collected directly from corn fields in Piracicaba-SP and field and laboratory populations were reared on artificial diet, corn, cotton, sorghum and rice. Ninety D. saccharalis caterpillars and 40 S. frugiperda caterpillars were used. The microbiota community of each caterpillar was evaluated individually. The ability of bacterial isolates to degrade cellulose, hemicellulose, lignin and sugarcane bagasse was assessed. The molecular analyses were based on Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) of 16S ribosomal RNA sequences amplified from metagenomic DNA extracted from 57 individual midgut of D. saccharalis and 26 from S. frugiperda. Latter, 6 of these metagenomic DNA of each insect species were cloned and the 12 clone libraries were sequenced. The cultivable bacterial community of these two insect species is composed by representatives of the phyla Firmicutes, Proteobacteria and Actinobacteria. The phylotypes from the clone libraries of 16S rRNA were comprised by Bacteroidetes in D. saccharalis and Bacteroidetes and Acidobacteria in S. frugiperda, besides the three phyla found by culturing. Only bacteria isolated from D. saccharalis had ability to degrade cellulose, hemicelluloses, lignin and sugarcane bagasse in the in vitro tests. The ability to degrade cellulose was more common than the ability to degrade hemicelullose and just a few isolates had the ability to degrade lignin. The only two bacteria presenting a positive response to degradation of all carbon sources were clustered with Phyllobacterium trifolii and Bacillus subtilis. The greatest number of cultivable bacteria sequences belongs to genera Bacillus (26.4 and 32.4%, in D. saccharalis and S. frugiperda, respectively), Enterococcus (12.1 and 13%) and Microbacterium (18 and 12%). Sequence analysis from metagenomic DNA revealed the genera Klebsiella in all samples from D. saccharalis. Bacterial community varied according to S. frugiperda host plant; however, both Ralstonia and Hydrogenophilus genera were present in the digestive tracts of insects from most host plants. Community structure variation of S. frugiperda and D. saccharalis is related directly to insect population origin and type of insect food source. The constant presence of some bacteria in the majority of insects indicates that those microorganisms might either be indispensable, playing a vital role to the insect, or have some symbiotic or commensal relation with the insect.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-16032010-161656 |
| Date | 10 February 2010 |
| Creators | John Jairo Saldarriaga Ausique |
| Contributors | Italo Delalibera Junior, Gilberto Ubida Leite Braga, Marcio Rodrigues Lambais |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Entomologia, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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