A presença de inibidores no plasma e soro de animais resistentes ao veneno de serpentes, assim como no plasma ou soro de serpentes imunes a seu próprio veneno, é amplamente conhecida. Um grupo destes inibidores são os inibidores de metaloproteases do veneno de serpente (SVMPs), eles têm sido caracterizados do ponto de vista físico químico, porém a falta de informações estruturais e termodinâmicas acerca da sua inibição sobre as SVMPs, tem permanecido como um grande obstáculo para sua aplicação terapêutica ou desenvolvimento como ferramentas moleculares. Por tanto, isolamos um novo inibidor de metaloproteases a partir do soro de C. d. terrificus, por nós denominado crotaini, e realizamos a caracterização cinética de sua interação com a bothropasina, uma das principais metaloproteases do veneno de B. jararaca, e da mesma forma, caracterizamos cineticamente a interação desta metaloprotease com dos inibidores já conhecidos, DM40 e DM43, isolados do soro de D. marsupialis. Determinando as constantes cinéticas mediante cinética enzimática e ressonância plasmônica de superfície (SPR) no Biacore T200. Os valores obtidos permitiram estabelecer que a interação entre o crotaini e a bothropasina, é de alta afinidade, além de evidenciar a sua ligação de forma equimolar e estável. Assim mesmo, o crotaini apresentou uma constante de inibição menor às constantes determinadas para o DM40 e DM43. Adicionalmente, estudos de interação após tratamento quelante da enzima permitem prever que existem diferenças respeito aos domínios estruturais envolvidos na interação do crotaini com a bothropasina, em comparação aos inibidores DM40 e DM43. / The presence of inhibitors in plasma or serum from snake venom - resistant animals is well known. These inhibitors are also present in plasma and serum of snakes that are immune to their own venom. A group of these molecules are snake venom metalloprotease inhibitors (SVMPIs). Although the physicochemical properties of these inhibitors are well established, the lack of structural and thermodynamic information has been a bottleneck for their therapeutic use and development as molecular tools. In this work a new metalloprotease inhibitor was isolated from C. d. terrificus, and named crotaini. The kinetic interaction of crotaini with bothropasin, one of the main metalloproteases from the B. jararaca venom, was investigated. Similarly, the kinetic interactions of crotaini with the inhibitors DM40 and DM43, isolated from D. marsupialis serum, were also studied. The kinetic constants were determined by enzymatic kinetics and surface plasmonic resonance (SPR) in a Biacore T200. The obtained values enabled us to demonstrate the high affinity of the inhibitors toward the metalloprotease, achieved through an equimolar and stable complex formation. In addition, studies of interactions of the metaloprotease bothropasin with its inhibitors in the presence of chelant agents revealed differences between that established with crotaini as compared with those made with DM40 and DM43.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29072019-141825 |
| Date | 11 March 2019 |
| Creators | Zapata Palacio, Tatiana |
| Contributors | Oliveira, Eduardo Brandt de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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