Trombocitopenia e diminuição da função plaquetária são achados comuns em pacientes picados por serpentes do gênero Bothrops. Sabe-se que o veneno de Bothrops jararaca (VBj) apresenta compostos com características pró e anti-agregantes plaquetárias, porém existem poucos estudos sobre a influência do veneno total assim como das principais famílias de proteínas que o compõem sobre as funções plaquetárias. A utilização de modelos experimentais é essencial para entender as desordens plaquetárias em humanos que culminam em sangramentos diversos. Portanto, o objetivo deste estudo foi (i) comparar as respostas ex vivo de plaquetas lavadas de humanos e de camundongos frente ao VBj, assim como entender a participação de serinaproteinases (SVSP) e metaloproteinases (SVMP) presentes no veneno sobre a agregação dessas plaquetas; e (ii) delimitar dentro do complexo proteico do veneno os compostos que induzem a trombocitopenia em camundongos após 3 horas do início do envenenamento botrópico. As plaquetas lavadas de humanos e camundongos BALB/c, C57BL/6 e do mutante natural pérola (Ap3b1-/-) apresentaram respostas de agregação máxima ao VBj na concentração de 24,4 ?g/mL, porém esta concentração provocou uma agregação menos intensa em plaquetas humanas quando comparada àquela observada nas linhagens BALB/c e C57BL/6. Mesmo em plaquetas de camundongos pérolas, deficientes em corpos densos plaquetários, o VBj se mostrou um potente agonista, promovendo a agregação plaquetária sem a necessidade da secreção do conteúdo granular. A ação agonista do veneno promoveu a secreção de ATP presente nos corpos densos plaquetários de humanos e das linhagens BALB/c e C57BL/6 de forma tão intensa quanto à provocada pela trombina, assim como a secreção de PF4 presente nos grânulos ? de plaquetas humanas e de camundongos BALB/c. Já em relação à secreção lisossomal, observou-se que as plaquetas humanas secretam níveis mais baixos de ?-hexosaminidase quando estimuladas com VBj do que pela trombina, enquanto que em plaquetas de camundongos BALB/c a secreção lisossomal ao VBj foi superior à constatada com a trombina. Os baixos níveis de lactato desidrogenase (LDH) no sobrenadante das plaquetas estudadas mostraram ausência de atividade direta citotóxica pelo VBj. Para verificar se as principais classes de famílias de enzimas do VBj, SVMP e SVSP, estavam envolvidas na ativação plaquetária ex vivo, elas foram inibidas com Na2EDTA (13 mM) e AEBSF (8 mM), respectivamente. Observou-se que em plaquetas humanas as serinaproteases são importantes para a agregação ex vivo, enquanto a agregação das plaquetas de camundongos BALB/c foi independente dessa classe de toxinas. Os resultados dos ensaios in vivo demonstraram que as proteínas do VBj com peso molecular inferior a 50 kDa (UF < 50 kDa) são importantes para o estabelecimento da trombocitopenia em camundongos BALB/c que receberam essa fração por via subcutânea e que esse quadro é independente de manifestações hemorrágicas e do desenvolvimento de coagulopatia durante o envenenamento botrópico. A caracterização dos compostos presentes no UF < 50 kDa foi realizada por espectrometria de massas e foi observada a presença predominante de metaloproteinases (37%) e proteínas similares às lectinas do tipo-C (33%), enquanto serinaproteases (17%), fosfolipases A2 (10%) e outros compostos (3%) somaram 30% da fração UF < 50 kDa. Em conclusão, o veneno é um potente agonista plaquetário que promove agregação, aglutinação e secreção de plaquetas humanas e de camundongos, independente da secreção de corpos densos plaquetários, e a fração do veneno responsável pela trombocitopenia em camundongos BALB/c tem peso molecular menor que 50 kDa / Thrombocytopenia and platelet dysfunction are common findings in patients bitten by Bothrops jararaca snakes. Pro- and anti-aggregating toxins have been isolated from Bothrops jararaca venom (BjV), but only few studies have been carried out about the effects of crude BjV and its main families of enzymes on platelet function ex vivo, as well as to understand their relevance to the pathophysiological events that occur during B. jararaca envenomation. Animal models have been used to understand platelet disorders in humans that culminate in bleeding manifestations. Thus, the aim of this study was to investigate (i) the effects of BjV, and snake venom serine proteinases (SVSP) and snake venom metalloproteinases (SVMP) contained therein, on aggregation and secretion in suspensions of washed human and mouse platelets, and (ii) to determine the BjV fractions, obtained by ultrafiltration, that induce thrombocytopenia in BALB/c mice after 3 h of administration of Bothrops envenomation. Washed platelets from humans and BALB/c, C57BL/6 and pearl (Ap3b1-/-) mice showed maximal aggregation responses to BjV at the concentration of 24.4 ?g/mL. However, this concentration aggregated less intensely platelets from humans than BALB/c or C57BL/6 mice. Even in pearl mouse platelets, which are deficient in dense bodies, BjV proved to be a potent agonist, promoting platelet aggregation without the requirement of granule content secretion. Nonetheless, BjV induced secretion of ATP, present in dense bodies, and PF4, present in ? granules, in the same extent as thrombin, from platelets of humans and mice. In regard to lysosomal secretion, it was observed that human platelets secreted low ?-hexosaminidase levels when stimulated by BjV than thrombin, whereas in BALB/c platelets higher secretion was induced by BjV than by thrombin. Release of lactate dehydrogenase (LDH) was similar between BjV and thrombin, evidencing the absence of cytotoxic activity by BjV on platelets. Inhibition of SVMP and SVSP, using Na2EDTA (13 mM) and AEBSF (8 mM), respectively, demonstrated that SVSP are important for ex vivo aggregation only in human platelets, whilst BALB/c platelet aggregation was independent of both of them. In in vivo studies, only BjV toxins with molecular weight less than 50 kDa (UF50) caused thrombocytopenia when administered s.c. to BALB/c mice, and it was independent of hemorrhagic manifestations and consumptive coagulopathy. Characterization by mass spectrometry of these toxins present in UF50 showed the predominant presence of SVMP (37%) and type-C lectin proteins (33%) were observed, while SVSP (17%), phospholipases A2 (10%) and other proteins (3%) accounted for the remaining toxins in UF50. In conclusion, BjV is a potent platelet activating agent that promotes aggregation, agglutination and secretion of human and mouse platelets, independent of secretion of dense platelet bodies, and the fraction of venom responsible for thrombocytopenia in BALB / c mice has a molecular weight less than 50 kDa
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-15012019-082126 |
| Date | 14 November 2018 |
| Creators | Rosa, Jaqueline Gomes |
| Contributors | Santoro, Marcelo Larami |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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