Gliotoxin ist ein ubiquitär vorkommendes Mykotoxin und wird unter anderem von Aspergillus sp. gebildet. Das Gliotoxin ist toxisch und stellt für Mensch und Tier ein gesundheitliches Risiko dar. Über die Aufnahme von kontaminierten Futtermitteln (FM) kann es in tierische Produkte und anschließend in die Nahrungsmittelkette gelangen. Dem Mykotoxin werden starke immunmodulatorische Eigenschaften zugeschrieben. Gliotoxin gilt als eine sehr reaktive Verbindung, die in der Umwelt schnell zu bis(methylthio)Gliotoxin (bmGliotoxin) umgesetzt werden kann. Dieser Metabolit ist sowohl atoxisch als auch biologisch inaktiv und wird aufgrund seiner Stabilität als ein wichtiger und zuverlässiger Diagnostikmarker beschrieben.
In der Mykotoxinanalytik werden Konzentrationsbestimmungen primär durch chromato-graphische Verfahren durchgeführt. Mit diesen Verfahren konnten bereits Gliotoxin-Konzentrationen in verschiedensten FM bestimmt werden. Im Gegensatz zu anderen prominenten Mykotoxinen gibt es für das Gliotoxin kein Nachweisverfahren für routinemäßige Kontrolluntersuchungen. Daher war das Ziel der Dissertationsarbeit die Entwicklung eines ELISA, mit dem Gliotoxin in FM einfach und schnell bestimmt werden kann.
Es wurden zunächst geeignete Protein-Gliotoxin-Konjugate für die Anti-Gliotoxin-Immunisierung hergestellt. Kaninchen wurden nach einem festgelegten Protokoll mit diesen Hapten-Konjugaten immunisiert (Kurzzeit- bzw. Langzeitimmunisierung). Anschließend erfolgte die Titerbestimmung in den Antiseren und die Überprüfung der Paratophemmbarkeit durch freies Gliotoxin. Aus dem Antiserum mit der höchsten IgG-anti-Gliotoxin-Konzentration wurden die Antikörper antigenaffinitäts-chromatografisch aufgereinigt. Zusätzlich wurde für den kompetitiven ELISA ein geeignetes Gliotoxin-Peroxidase-Konjugat hergestellt. Alle Testkomponenten wurden vorab geprüft und danach der kompetitive Gliotoxin-ELISA validiert.
Mit dem optimierten kompetitiven Testsystem wurden die Gliotoxin-Konzentrationen in Schimmelpilz-Kulturüberständen (Aspergillus sp.) gemessen. Anschließend erfolgte die Untersuchung von Futtermittelproben (Silagen) auf Gliotoxin. Nach der entsprechenden Probenaufbereitung der FM wurde das Gliotoxin im kompetitiven ELISA ebenfalls quantitativ bestimmt. Die hier gemessenen Gliotoxin-Konzentrationen wurden mit Ergebnissen aus parallel durchgeführten Untersuchungen mit der LC-MS/MS verglichen.
Mit dem entwickelten kompetitiven ELISA sind quantitative Aussagen zu erhöhten Gliotoxin-Konzentrationen in verschiedenen Probenmaterialien möglich. Das Mykotoxin kann sowohl frei in seiner nativen Form, gebunden an Proteine oder metabolisiert als bis(methylthio)gliotoxin detektiert werden. Mit dem Testsystem kann die quantitative Produktion von Gliotoxin durch verschiedene Schimmelpilzarten beurteilt werden. Die untersuchten FM (Silageproben) konnten im entwickelten ELISA alle erfolgreich gemessen und beurteilt werden.:1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 2
2.1 Schimmelpilze 2
2.1.1 Definition und Zuordnung 2
2.1.2 Vorkommen in der Umwelt 4
2.1.3 Bedeutung und Nutzen 5
2.1.4 Schadwirkung für Mensch und Tier 7
2.2 Mykotoxine 9
2.3 Gliotoxin 10
2.3.1 Allgemeine Merkmale 10
2.3.2 Bis(methylthio)Gliotoxin 16
2.3.3 Ausgewählte Pathogenitätsmechanismen 17
2.3.3.1 Redox-Zirkel und ROS-Produktion 17
2.3.3.2 Verschiebung des TH1/ TH2-Gleichgewichtes 18
2.3.3.3 Inhibition des Transkriptionsfaktors NF-κB 19
2.3.3.4 Einleitung von Apoptose und Nekrose 20
2.3.3.5 Inhibition von Mastzellen 21
2.3.4 Nachweisverfahren 22
2.3.4.1 Chromatographie 22
2.3.4.2 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) 23
2.3.5 Quantitative Mengenbestimmungen in Proben 25
2.3.5.1 Klinisches Probenmaterial 25
2.3.5.2 Belastete Futtermittelproben 27
2.3.5.3 Belastete Lebensmittelproben 33
3 Material und Methoden 34
3.1 Gliotoxin, Chemikalien und ausgewählte Laborgeräte 34
3.2 Gliotoxin-Hapten für die Immunisierung 35
3.3 Immunisierung 37
3.4 Untersuchung der Anti-Gliotoxin-Antiseren 37
3.4.1 Protein-Gliotoxin-Konjugate für ELISA 37
3.4.2 ELISA für Antiserumuntersuchung 39
3.4.3 ELISA für die Bestimmung der IgG-Konzentrationen anti-Gliotoxin 40
3.5 Etablierung des kompetitiven Gliotoxin-ELISA 42
3.5.1 Isolierung der IgG-anti-Gliotoxin 42
3.5.2 Herstellung des Gliotoxin-HRP-Konjugates 43
3.5.3 Prüfung der Testkomponenten 44
3.5.4 Validierung des kompetitiven Gliotoxin-ELISA 45
3.6 Untersuchung von Kreuzreaktionen 45
3.7 Untersuchung von Pilzkulturen auf Gliotoxin 45
3.8 Untersuchung von Futtermitteln auf Gliotoxin 47
3.8.1 Untersuchung von dotiertem Futtermittel 47
3.8.2 Futtermitteluntersuchung mit dem Gliotoxin-ELISA 48
3.8.3 Futtermitteluntersuchung mit der LC-MS/MS 49
3.9 Datenauswertung 49
4 Ergebnisse 50
4.1 Hapten für die Immunisierung 50
4.2 Untersuchung der Anti-Gliotoxin-Antiseren 50
4.2.1 Titerbestimmung 50
4.2.2 Bestimmung der Hemmungsrate durch freies Gliotoxin 51
4.2.3 IgG-anti-Gliotoxin-Konzentration in den Antiseren 53
4.3 Untersuchung der Antiseren 55
4.3.1 Isolierung des IgG-anti-Gliotoxin 55
4.3.2 Voruntersuchungen für die Etablierung des kompetitiven Gliotoxin-ELISA 57
4.3.3 Validierung des kompetitiven Gliotoxin-ELISA 60
4.4 Untersuchung von Kreuzreaktionen 64
4.5 Untersuchung von Pilzkulturen auf Gliotoxin 65
4.6 Untersuchung von Futtermitteln auf Gliotoxin 68
4.6.1 Untersuchung mit Gliotoxin dotierter Futtermittel 68
4.6.2 Futtermitteluntersuchung mit Gliotoxin-ELISA und LC-MS/MS 71
4.7 Auswertung und Bewertung 73
5 Diskussion 78
5.1 Bewertung der Gliotoxin-Antigen Entwicklung 78
5.2 Bewertung der Antiseren nach Immunisierung (28d- und 91d-Protokoll) 79
5.3 Etablierung des kompetitiven ELISA 83
5.4 Bewertung der Pilze und der Kulturüberstände 85
5.5 Bewertung der Futtermittel 88
6 Zusammenfassung 96
7 Summary 98
8 Literaturverzeichnis 100
9 Anhang 116
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:79396 |
| Date | 07 June 2022 |
| Creators | Lindenhahn, Jakob |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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