A terapia gênica por interferência de RNA (RNAi) é um processo de silenciamento gênico pós-transcricional onde moléculas de small interfering RNA (siRNA) específicas são capazes de suprimir a expressão de um determinado gene. Atualmente, é uma abordagem terapêutica promissora para o tratamento de muitas doenças graves, incluindo doenças cutâneas. No entanto, dificuldades relacionadas à administração e à biodistribuição limitam a utilização clínica dos siRNAs. Neste contexto, foi proposto o uso de um nanocarreador a base de cristais líquidos para viabilizar a aplicação de siRNAs no tratamento tópico da psoríase. A nanodispersão líquido-cristalina (NLC) desenvolvida, composta por monoleína, ácido oleico, polietilenoimina e fase aquosa (8:2:1:89, p/p/p/p), foi capaz de superar as barreiras da via de administração tópica, bem como as limitações resultantes das características das moléculas de siRNA. A NLC foi capaz de complexar o siRNA, protege-lo por 24 h da degradação enzimática e liberá-lo de forma intacta. A NLC promoveu uma alta taxa de captação celular do siRNA em fibroblastos e macrófagos. Sua aplicação tópica pode ser considerada segura para a pele, pois manteve a viabilidade da epiderme humana reconstruída acima de 50% e a quantidade de IL-1? liberada foi inferior a 60 pg/mL. A NLC apresentou eficácia em promover a liberação funcional do siRNA nos modelos in vitro avaliados. No modelo de pele humana reconstruída psoriática, reduziu os níveis de IL-6 (~ 70%) após um único tratamento por 6 h e, os níveis do RNAm IL6 (~ 50%) após o tratamento por 3 dias consecutivos. Em macrófagos, reduziu os níveis do RNAm Tnf em 40% após o tratamento concomitante com LPS por 24 h e, em 60% após o tratamento por 24 h pós-estímulo prévio com LPS. A eficácia foi ainda maior com o pré-tratamento por 24 h seguido do estímulo com LPS, que normalizou os níveis do RNAm Tnf. O tratamento tópico com a NLC veiculando siRNA Tnf foi eficaz em reduzir significativamente os níveis do RNAm Tnf nos modelos in vivo de inflamação cutânea aguda induzida por TPA (~ 60%) e de psoríase induzida por imiquimode (~ 90%) avaliados. No modelo in vivo de psoríase, o tratamento tópico com a NLC veiculando siRNA Tnf também reduziu significativamente a atividade da mieloperoxidade (~ 65%) e a espessura da epiderme (~ 70%) em comparação aos grupos controle. Também foi eficaz na melhora fenotípica dos animais, reduzindo o rubor, descamação, acantose e o número de ataques de coceira, resultados da redução do processo inflamatório decorrente da ação efetiva das moléculas de siRNA Tnf. A NLC também promoveu a penetração cutânea das moléculas de siRNA nas camadas mais profundas da pele, in vivo. Face aos resultados obtidos, pode-se concluir que a NLC é uma estratégia relevante para a administração tópica de siRNAs, que mostrou potencial terapêutico para suprimir genes específicos relacionados a doenças de pele. / Gene therapy by RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional gene silencing process in which specific small interfering RNA (siRNA) molecules can suppress the expression of a particular gene. Currently, is a promising therapeutic approach for the treatment of many severe disorders, including skin diseases. However, difficulties related to the administration and biodistribution limit the clinical use of siRNAs. In this context, a nanocarrier based in liquid crystal has been proposed to enable the application of siRNAs in the topical treatment of psoriasis. The liquid crystalline nanodispersion (LCN) developed, composed by monoolein, oleic acid, polyethylenimine and aqueous phase (8:2:1:89, w/w/w/w), was able to overcome the barriers of topical administration route, as well as limitations resulting from the characteristics of the siRNA molecules. The LCN was able to complex the siRNA, protect it for 24 h from enzymatic degradation and release it in an intact form. The LNC promoted a high cellular uptake of siRNA in fibroblasts and macrophages. Its topical application can be considered safe to the skin since viability of the reconstructed human epidermis remained above 50% and the amount of IL-1? released is less than 60 pg/mL. The LCN showed efficacy in promoting functional release of siRNA in in vitro models evaluated. In psoriatic reconstructed human skin model, it reduced the IL-6 levels (~ 70%) after a single treatment for 6 h and the mRNA IL6 levels (~ 50%) after treatment for 3 consecutive days. In macrophages, it reduced the mRNA Tnf levels in 40% after the concomitant treatment with LPS for 24 h and, in 60% with treatment for 24 h after prior stimulation with LPS. The efficiency was higher with the pretreatment for 24 h followed by stimulation with LPS, that normalized the RNAm Tnf levels. Topical treatment with NLC carrying siRNA Tnf was effective in reduce significantly the mRNA Tnf levels in in vivo models of skin acute inflammation induced by TPA (~ 60%) and of psoriasis induced by imiquimod (~ 90%) evaluated. In the in vivo model of psoriasis, topical treatment with the NLC carrying siRNA Tnf also significantly reduced activity of myeloperoxidase (~ 65%) and the epidermis thickness (~ 70%) compared to control groups. It has also been effective in animal phenotypic improvement, reducing redness, desquamation, acanthosis and the number of itch attacks, results of the reduction in inflammatory process obtained by the effective action of siRNA Tnf molecules. The LCN also promoted the penetration of siRNA molecules into the deeper layers of the skin in vivo. With the results obtained, we can conclude that the LCN is a relevant strategy for topical administration of siRNAs, which showed therapeutic potential to suppress specific genes related to skin diseases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-05102016-093901 |
| Date | 05 August 2016 |
| Creators | Depieri, Lívia Vieira |
| Contributors | Bentley, Maria Vitoria Lopes Badra |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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