L-asparaginase (L-ASNase) é uma enzima com propriedades interessantes para a indústria médica, farmacêutica e de alimentos, que tem recebido atenção especial, inclusive no Brasil, por fazer parte do protocolo de tratamento de distúrbios linfoproliferativos, como a leucemia linfoblástica aguda (LLA). No mercado desde a década de 1970, as enzimas de origem bacteriana enfrentam algumas limitações por provocarem reações adversas graves em quase 80% dos pacientes em tratamento. Nesse contexto, L-ASNases provenientes de leveduras se destacam como alternativa, por serem mais próximas às congêneres humanas. A Antártica ainda é um ambiente pouco explorado, com grande diversidade de microrganismos com potencial para a produção de moléculas biológicas de interesse industrial. Nesse contexto, 150 leveduras isoladas de amostras de sedimento marinho coletadas na Península Antártica como parte do projeto MICROSFERA (PROANTAR/CNPq) foram avaliadas para a produção de L-ASNase. A triagem resultou em 9 isolados produtores, dos quais 7 pertencem ao gênero Leucosporidium. A linhagem L. muscorum CRM 1648 foi a que produziu mais enzima (540 U.L-1), com maior produtividade (5,6 U.L-1.h-1) e, por isso, foi alvo deste estudo. A análise univariada de fontes de carbono e nitrogênio indicou maior crescimento desse microrganismo e produção de L-ASNase em meio CD com extrato de levedura, prolina e sacarose. Ureia, cloreto de amônio e sulfato de amônio resultaram em baixa ou nenhuma produção da enzima, sugerindo que a metabolização de fontes de nitrogênio por essa linhagem está sob a influência do fenômeno de repressão catabólica pelo nitrogênio (RCN). Dois delineamentos experimentais do tipo fatorial completo resultaram em um aumento de 10 vezes na produção e produtividade da enzima (4582,5 U.L-1 e 63,6 U.L-1.h-1, respectivamente). A análise univariada da concentração inicial de inóculo (X0), pH inicial do meio, temperatura e adição de água do mar mostrou que a melhor condição para a produção foi: pH = 5,5 ou 6,5, cultivo a 15°C com adição de água do mar (25-50% m/v). A variável X0 não foi significativa nas concentrações avaliadas. Cultivos em biorreator (batelada) foram conduzidos em quatro diferentes níveis de oxigênio dissolvido (OD): (1) OD não controlado e abaixo de 20%, (2) OD não controlado e acima de 20%, (3) OD controlado em 80% e (4) OD controlado em 20%. Os resultados mostraram que OD é fator limitante para o crescimento de L. muscorum CRM 1648 e produção de L-ASNase por essa levedura e deve ser mantido acima de 35% para maior produção da enzima.Neste trabalho, a composição do meio e condições de cultivo foram estabelecidas para favorecer a produção de uma nova L-ASNase livre de atividade glutaminásica por levedura adaptada ao frio, abrindo espaço para novos estudos acerca de seu potencial antileucêmico e possível uso como alternativa às enzimas já existentes no mercado no tratamento de LLA. / L-asparaginase (L-ASNase) is an enzyme with interesting properties for medical, pharmaceutical and food industry, which has received special consideration, especially in Brazil, for being part of lymphoproliferative disorders treatment, such as acute lymphoblastic leukemia (ALL). Bacterial enzymes are on the market since the 1970s and face some limitations related to theirserious adverse reactions that reach almost 80% of all patients in treatment. In this context, L-ASNases from yeasts are highlighted as important alternative to bacterial enzymes, due to the closerphylogeny to human congeners. Antarctic environment has much to be explored, with a vast diversity of microorganisms with potential to produce biomolecules with industrial interest. A total of 150 yeasts isolated from Antarctic marine sediments as part of MICROSFERA project (PROANTAR/CNPq) were evaluated for L-ASNase production. The screening resulted in 9 producers, 7 species from the genus Leucosporidium. L. muscorum CRM 1648 was the strain that yielded the highest L-ASNase activity (540 U.L-1) and volumetric productivity (5.6 U.L-1.h-1). Carbon and Nitrogen sources were evaluated by a method of one-factor at a time (OFAT). From the gather results, sucrose, yeast extract and proline resulted in a maximal growth and highest enzyme production.The absence or low production of L-ASNase in medium with urea, ammonium chloride and ammonium sulfate suggests the presence of nitrogen catabolic repression (NCR). Carbon and nitrogen concentration were evaluated by full factorial design and yielded about ten times higher enzyme and volumetric productivity (4582.5 U.L-1 and 63.6 U.L-1.h-1, respectively). Initial inoculum concentration (X0), initial pH, temperature and concentration of seawater in the culture were evaluated by OFAT analysis and the best condition for L-ASNase production was: pH = 5.5 or 6.5, at 15 °C with addition of seawater (25-50 wt%). X0 was not considered a significant variable. Bioreactor assays (in batch regime) were performed in four different dissolved oxygen (DO) levels: (1) without DO control (DO remained under 20%), (2) without DO control (DO remained above 20%), (3) DO controlled at 80%, and (4) DO controlled at 20%.The results showed that DO is a key factor for growth of L. muscorum CRM 1648 and production of L-ASNase by this yeast and should be maintained above 35% for higher production of this enzyme.At this work, the medium and culture conditions were established to support the production of a novel glutaminase-free L-ASNase by a cold adapted yeast, opening a new path for further studies regarding its antileukemic potential and possible use as an alternative for ALL treatment.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-31072019-120509 |
| Date | 19 June 2019 |
| Creators | Freire, Rominne Karla Barros |
| Contributors | Pessoa Junior, Adalberto, Tonso, Aldo |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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