Este trabalho teve como objetivo a prospecção e caracterização de enzimas fúngicas, que degradam a biomassa, visando à aplicação no biobranqueamento da polpa de celulose. Para isto, foram selecionados 13 fungos filamentosos da Micoteca e entre estes Aspergillus versicolor e A. brasiliensis foram aqueles que se sobressaíram quanto à produção de xilanase, amilase, CMCase, avicelase e ?-glucosidase. As melhores condições de produção enzimática corresponderam à utilização de bagaço de cevada como fonte de carbono em meio SR (Segato Rizzatti) para xilanase, amilase e ?- glucosidase e meio M5 para CMCase, avicelase e FPase, nos cultivos incubados por tempos variáveis de 72 a 168 horas. Para otimizar a concentração da fonte de carbono e a temperatura nos cultivos foi realizado um Delineamentro Composto Central Rotacional. Como resultante da otimização do bioprocesso foram obtidos os extratos brutos: (i) meio BSR, para a produção de xilanase por A. brasiliensis, com 96 horas de cultivo estático, a 30°C, com bagaço de cevada 3% em meio SR; (ii) Meio VSR para amilase e ?-glucosidase a partir do A. versicolor, com 120 horas de cultivo estático, a 35°C, com bagaço de cevada 3,41% em meio SR; (iii) Meio VM5 para CMCase, avicelase e FPase de A. versicolor com 120 horas de cultivo estático, a 30°C, com bagaço de cevada 2% em meio M5. Lacase foi produzida por Trametes versicolor (iv), cultivado por quinze dias em Fermentação Submersa estática, a 30°C, em meio contendo vinhaça e água destilada (1:5 v/v), 1% de algodão e 0,1% de peptona. Paralelamente, a produção de xilanases de A. tamarii Kita (v) com bagaço de cevada 2,9% foi otimizada em meio ADAMS por 129 horas (recebendo a denominação - meio TKADAMS). Quanto à caracterização das enzimas de A. versicolor (xilanase) e A. brasiliensis (demais enzimas) a temperatura ótima de xilanase foi 70°C; amilase 60-65°C; CMCase 65°C; avicelase 50°C; FPase e lacase 60°C e ?-glucosidase 70-75°C. Quanto à estabilidade térmica, xilanase mostrou-se com 60% de atividade relativa por até 24 horas à 40°C e 30 minutos à 50°C. A 60°C mostrou-se pouco estável. A amilase mostrou-se estável por 24 horas a 40 e 50°C, com 80% da atividade relativa. CMCase e FPase mostraram-se pouco estável nas temperaturas citadas. Avicelase apresentou ativação quando exposta ao aquecimento de 40, 50 e 60°C. ?-glucosidase foi estável a 40°C por até 24 horas, com atividade relativa de 80%; a 50°C apresentou 60% de atividade relativa por 180 minutos e a 60°C exibiu 40% por até 30 minutos. Lacase foi estável a 50°C, com um t50 de 60 minutos; a 60°C teve atividade relativa próxima de 30%, por até 240 minutos e a 70°C apresentou 40% de atividade por 30 minutos. Quanto ao pH, xilanase apresentou uma faixa ótima de 4,0-5,0 e também entre 7,0-8,0. Amilase, CMCase, avicelase, FPase, ?-glucosidase e lacase apresentaram atividades mais expressivas na faixa de pH 4,0-5,5. Com relação à estabilidade ao pH em 24 horas, xilanase foi mais estável nos pH 5,5-7,0, amilase nos pH 5,0-6,5, CMCase, FPase e lacase em pH 4,5, avicelase em pH 3,0 e ?-glucosidase em pH 5,0-5,5. Quanto ao efeito de íons, CMCase e ?-glucosidase foram ativadas por K+, Zn+ e Ba2+; CMCase, ?-glucosidase e lacase foram ativadas por NH4+ e Ca2+; amilase, CMCase, ?-glucosidase e lacase foram ativadas por Co2+; amilase, CMCase e ?- glucosidase foram ativadas por Al3+ e Fe2+; xilanase, avicelase, CMCase e ?-glucosidase foram ativadas por Mn+; avicelase e CMCase foram ativadas por Ag+; lacase por EDTA; ?-glucosidase e lacase por Mg2+, CMCase por Hg2+ e xilanase, ?-glucosidase e lacase por Cu2+. Os extratos foram utilizados na formulação de coquetéis enzimáticos para biobranqueamento da polpa de celulose. A aplicação dos extratos BSR, VSR, VM5 sobre a polpa marrom não resultou em uma redução significativa do número Kappa quando comparados ao controle, uma vez que todos os extratos apresentavam uma coloração muito escura, a qual fora originada por componentes e pigmentos provenientes dos meios de cultivo dos micro-organismos com bagaço de cevada e que, consequentemente, interferiram na determinação do número Kappa. Desta forma, o coquetel otimizado teve como formulação: 20,3 mL do meio TKADAMS e 10 mL do extrato do meio produtor de lacase para cada 4 gramas de polpa tratada, pH 5,5; 35,9ºC, 48 horas. Este tratamento resultou na redução de 1,83 pontos no número Kappa da polpa marrom, representando uma eficiência de 20,3%, e aumento de 4,65 na alvura, em relação ao controle. A aplicação do coquetel nos resíduos lignocelulósicos ocasionou a formação máxima de 85 mg/mL de açúcares redutores, em 24 horas no tratamento do bagaço de cevada, e 25 mg/mL de açúcares redutores, em 3 horas no tratamento do bagaço de cana. A aplicação do coquetel nas polpas de papel reciclado ocasionou um maior destintamento. A aplicação do coquetel desenvolvido na polpa de celulose, nos resíduos lignocelulósicos e fibras secundárias mostrou-se promissora para biobranqueamento, biodegradação e destintamento destes, respectivamente. A aplicação de enzimas no processo de biobranqueamento da polpa de celulose é uma alternativa viável e que auxilia a redução de custos, água, energia e colabora com o meio ambiente. A lacase foi importante no biobranqueamento da polpa de celulose sendo que o aumento da escala de produção do T. versicolor para biorreator levou a uma produção 6,25 vezes maior comparada aquela em Erlenmeyer, provavelmente devido a aeração constante / This work aimed to prospect and characterize fungal enzymes, which break biomass, looking for the cellulose pulp biobleaching application. For this, 13 filamentous fungi of the Fungi Library were selected and among them Aspergillus versicolor and A. brasiliensis were those that stood out as inducers of xylanase, amylase, CMCase, avicelase and ?-glucosidase production. The use of barley bagasse as carbon source was the best condition for xylanase, amylase and ?-glucosidase production in SR medium (Segato Rizzatti) and M5 medium was the best for CMCase, avicelase and FPase production, in cultures incubated for 72-168 h. In order to optimize the concentration of the carbon source and the temperature of the cultures, a Central Composite Rotational Design was elaborated. (i) BSR extract, in SR medium for the xylanase production by A. brasiliensis, 96 hours, in static culture, at 30°C with barley bagasse 3%; (ii) VSR extract, in SR medium, for the amylase and ?-glucosidase from A. versicolor, 120 hours in static culture, at 35°C, with barley bagasse 3.41%. (iii) VM5 extract, in M5 medium for CMCase, avicelase and FPase from A. versicolor, 120 hours of static culture, at 30°C with barley bagasse 2%. Lacase was produced by Trametes versicolor (iv), in a medium containing vinasse and distilled water (1:5 v/v), cotton 1% and peptone 0.1%, for 15 days at 30ºC. In parallel, the production of a xylanase from A. tamarii Kita (v) with barley bagasse 2.9% was optimized in ADAMS medium for 129 hours (designated - TKADAMS medium). The thermal stability study showed that xylanase was stable with 60% of relative activity at 40°C for up to 24 hours and for 30 minutes at 50°C. At 60°C the enzyme was poorly stable. Amylase was stable for 24 hours at 40 and 50°C, with 80% of relative activity. CMCase and FPase was poorly stable at all temperatures tested. Avicelase was activated by the exposure at 40, 50 and 60°C. ?-glucosidase was stable at 40°C for up to 24 hours, with 80% of relative activity; at 50°C it showed a relative activity of 60% for 180 minutes and at 60° it showed 40% of relative activity for 30 minutes. Laccase was stable at 50°C with t50 for 60 minutes. At 60°C it showed an activity of 30% for up to 240 minutes and at 70°C it showed 40% of activity for 30 minutes. As for pH, xylanase showed the best activity in a range of pH 4.0-5.0 and 7.0-8.0. Amylase, CMCase, avicelase, FPase, ?-glucosidase and laccase showed expressive activities in a range of pH 4.0-5.5. The tests of pH stability in 24 hours showed that xylanase was stable at pH 5.5-7.0, amylase at pH 5.0-6.5, CMCase, FPase and laccase at pH 4.5, avicelase at pH 3.0 and ?-glucosidase at pH 5.0-5.5. The effect of ions showed that CMCase and ?-glucosidase were activated by K+, Zn+ and Ba2+; CMCase, ?-glucosidase and lacase were activated by NH4+ and Ca2+; amylase, CMCase, ?-glucosidase and lacase were activated by Co2+; amylase, CMCase and ?-glucosidase by Al3+ and Fe2+; xylanase, avicelase, CMCase and ?-glucosidase by Mn+; avicelase and CMCase by Ag+; lacase by EDTA; ?-glucosidase e lacase by Mg2+, CMCase by Hg2+ and xylanase, ?-glucosidase and lacase by Cu2+. The extracts were used in the formulation of enzymatic cocktails for cellulose pulp biobleaching. The application of BSR, VSR and VM5 extracts on the brown pulp did not result on a significant reduction of the Kappa number when compared to the control, on account of the dark coloration of these extracts caused by the components and pigments from the cultivation with the microorganisms and barley bagasse, which as a consequence, interfered in the determination of the Kappa number. Thus, an optimized cocktail was formulated: for each 4 grams of treated pulp 20.3 mL of TKADAMS extract and 10 mL of laccase extract, pH 5.5; 35.9°C, 48 hours. This treatment resulted in the reduction of 1.83 points in the Kappa number of the brown pulp, representing an efficiency of 20.3%, and a brightness increase of 4.65 when compared to the control. The application of the cocktail in the lignocellulosic residues resulted in the formation of 85 mg/mL of reducing sugars in barley bagasse treatment for 24 hours and, 25 mg/ml of reducing sugars in sugarcane bagasse treatment for 3 hours. The application of the cocktail in the recycled paper pulps caused a greater deinking. The application of the formulated cocktail in the cellulose pulp, lignocellulosic residues and secondary fibres was promising for biobleaching, biodegradation and deinking, respectively. The enzyme application in cellulose biobleaching is a viable alternative, which helps reducing costs, water, energy and collaborates with the environment. Laccase was important in the cellulose biobleaching and the increase of its production by T. versicolor through bioreactor led to a production 6.25 times higher than that in Erlenmeyer, probably due to the constant aeration
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-26042018-170614 |
| Date | 30 June 2017 |
| Creators | Pinheiro, Vanessa Elisa |
| Contributors | Polizeli, Maria de Lourdes Teixeira de Moraes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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