Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2016. / Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo restrito: Resultados e Discussão. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-15T16:44:15Z
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2016_TatianaGuerreroMarçola_Parcial.pdf: 4029867 bytes, checksum: 687fe7732a92c58f931225d527f324c3 (MD5) / Leishmaniose é uma doença complexa que envolve diversas sinalizações principalmente via resposta imune inata através dos macrófagos. O estudo da doença é normalmente realizado in vitro, entretanto há uma grande variedade de macrógfagos usados, formas do parasita, espécies do parasita e linhagens de animais. Sabe-se que o parasita Leishmania spp. de alguma forma consegue subverter o tipo de polarização de macrófagos, desta forma manipula etapas imunes essenciais do hospedeiro, permanecendo e proliferando dentro do seu organismo. O padrão de citocinas produzido por macrófagos tem retroalimentação com linfócitos T, citocinas como IL-12, INF- e IL-6 que possuem perfil pró-inflamatório e estimulam linfócitos Th1, os quais estão associados com animais de linhagens resistentes como C3H/he. Por outro lado o perfil de citocinas anti-inflamatório tende a estimular linfócitos Th2, que estão bem associados a animais susceptíveis como Balb/c. Trabalhos mostram que diversos patógenos são capazes de manipular diferentes etapas da resposta imune inata, autores já descrevem que parasitas, vírus e bactérias são capazes de modificar etapas epigenéticas do hospedeiro. Epigenetica envolve mecanismo capazes de alterar e coordenar a expressão dos genes, um deste mecanismos é a metilação de DNA. Metilação de DNA é uma modificação química no carbono 5 de citosinas, tal modificação é encontrada normalmente em vertebrados e invertebrados, em situações fisiológicas e patológicas. Existem diversas metodologias para verificação dos níveis de metilação de DNA, a técnica de RRBS (Reduced representation bisulfite sequencing) é uma técnica barata, acessível e comparável as demais metodologias. O presente trabalho investigou os sítios de metilação de DNA em macrófagos peritoneais de duas diferentes linhagens (Balb/c e C3H/he), recuperados com lavagem ou estimulo por Tioglicolato de sódio. As células de ambas linhagens sem estímulo foram infectadas com L. infantum e L. amazonenses; as células com estímulo foram infectadas apenas com L. amazonenses. Após o período de 72 horas o DNA das células foi extraído e purificado para a preparação de bibliotecas de RRBS e sequenciamento em Hi-seq 2500. A análise das sequências foi feita pela ferramenta Rnbeads, que realizou as comparações – infecção x controle; linhagem resistente x susceptível; e macrófagos estímulo x sem estímulo. Através da distribuição beta e redução dimensional geradas pela ferramenta sugere-se que há diferenças consistente entre células recuperadas por Tioglicolato e células recuperadas com lavagem. As células estimuladas apresentam menor concentração de sítios metilados em regiões como promotores, genes e tiling. Entre animais resistentes (C3H/he) e susceptíveis (Balb/c) também foi observado que animais Balb/c tendem a ter menor concentração de metilação de DNA quando comparados a C3H/he, tal perfil não é devido a infecção. Apesar da sutil diferença na metilação de DNA entre infecção e controle, as linhagens demonstraram padrões opostos de metilação de DNA. Não foi possível distinguir mudanças nos sítios de metilação entre Leishmaniose cutânea e visceral. O presente trabalho sugere que há diferenças na metilação de DNA, sendo sutil no status de infecção e controle, moderado em animais resistentes e susceptíveis, e intenso entre células estimuladas e não estimuladas, e tais modificações são vistas em regiões importantes do genoma como promotores. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis is a complex disease involving many signals pathways in innate immune response mainly by macrophages. The study of the disease is usually in vitro, however, there are many of macrophages types, parasite form, parasite species and animals strains. It is known that the parasite Leishmania spp. can subvert the macrophages polarization, handles essential immune steps of the host, to live and spread within the host body. The cytokines pattern produced by macrophages has T lymphocytes feedback, cytokines such as IL-12, INF-γ and IL-6 which have a pro-inflammatory profile stimulate Th1 lymphocytes, which are associated with animal resistant strains as C3H / He. Furthermore, the anti-inflammatory cytokine profile stimulates Th2 lymphocytes which are associated with susceptible animals as Balb / c. Many pathogens are able to handle different stages of the innate immune response, the authors have described that parasites, virus and bacteria are able to modify the host epigenetic steps. Epigenetic are mechanism able to change and coordinate the gene expression, as DNA methylation. DNA methylation is a chemical modification of 5 carbon in cytosines, such modification is usually found in vertebrates and invertebrates, in physiological and pathological situations. There are several methodologies to investigate DNA methylation levels, RRBS technique (Reduced representation bisulfite sequencing) is an inexpensive and accessible technique, comparable to other methodologies. This study investigated the DNA methylation sites on peritoneal macrophages of two different strains (BALB/c and C3H/he), recovered by washing or stimulation by sodium thioglycolate. The cells of both strains without stimulation were infected with L. infantum and L. amazonensis; the cells with stimulus were just infected with L. amazonensis. After 72 hours the cell DNA was extracted and purified to the RRBS libraries preparation and sequencing by Hi-seq 2500. Sequence analysis was done by Rnbeads tool wich compared: infection x control; resistant x susceptible mice strain; and macrophages stimulated x without a stimulus. Through beta distribution and dimensionality reduction generated by the Rnbeads it is suggested that there are consistent differences between stimulated cells with thioglycollate and cells recovered by washing. Stimulated cells have a lower concentration of methylated sites in regions such as promoters, genes and tiling. Between resistant (C3H/He) and susceptible (BALB/c) animals was also observed that Balb/c animals have a lower concentration of DNA methylation than C3H/He, which is not due the infection. Although subtle differences in DNA methylation between infection and control, the strains response to infection showed opposite patterns of DNA methylation. It was not possible to distinguish changes in DNA methylation sites between cutaneous and visceral leishmaniasis. This study suggests that there are differences in DNA methylation in host-parasite interaction, which are subtle in infection and control status, moderate in resistant and susceptible animals, and intense between stimulated and unstimulated cells, such modifications can be seen in important regions of the genome as promoters.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/22189 |
| Date | 26 February 2016 |
| Creators | Marçola, Tatiana Guerrero |
| Contributors | Pereira, Rinaldo Wellerson, Walter, Jörn, Castro, Márcio Botelho de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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