As bases genéticas e moleculares da resistência de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) a lufenuron foram exploradas no presente estudo. Inicialmente, uma linhagem de S. frugiperda resistente a lufenuron foi selecionada a partir de uma população coletada na cultura do milho na região de Montevidiu-GO com intenso uso desse inseticida. As curvas de concentração-resposta a lufenuron para as linhagens de S. frugiperda suscetível (SUS) e resistente (LUF-R) a lufenuron foram caracterizadas pelo método de bioensaio com tratamento superficial da dieta artificial. As CL50 (I.C. 95%) estimadas para as linhagens SUS e LUF-R foram de 0,23 (0,18 - 0,28) e 210,6 (175,90 - 258,10) ?g de lufenuron.mL-1 respectivamente, com razão de resistência de ? 915 vezes. A partir dos resultados de cruzamentos recíprocos entre as linhagens SUS e LUF-R, concluiu-se que a herança da resistência de S. frugiperda a lufenuron é autossômica e incompletamente recessiva. Os testes de retrocruzamentos da progênie F1 de cruzamentos recíprocos com o parental LUF-R demonstraram um efeito poligênico para a resistência, com a estimativa do número mínimo de segregações independentes entre 1,54 e 1,71, indicando que o número de loci associado à resistência é baixo. Para conhecer o perfil de transcritos de lagartas de S. frugiperda e avaliar o padrão de expressão gênica diferencial entre lagartas da linhagem LUF-R em comparação ao de lagartas da linhagem SUS, buscando identificar o(s) mecanismo(s) de resistência a lufenuron, foram utilizadas novas tecnologias de sequenciamento em larga escala. Para isso, foram utilizados sequenciamentos de quatro bibliotecas de cDNA (plataforma HiScan 1000, Illumina©) obtidas de lagartas de 4º ínstar de S. frugiperda das linhagens LUF-R e SUS, induzidas ou não com lufenuron. O transcritoma foi construído utilizando aproximadamente 19,6 milhões de leituras single-end, o que gerou 18.506 transcritos, com N50 de 996 pb. A pesquisa contra o banco de dados nr (NCBI) proporcionou anotação funcional de 51,1% (9.457) dos transcritos obtidos, grande parte dos alinhamentos apresentaram homologia a insetos, com o maior número deles (45%) se assemelhando aos de Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae), enquanto 10% se assemelharam a sequências de diversas espécies do gênero Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), sendo 3% dos alinhamentos obtidos contra sequências de Spodoptera frugiperda. A análise comparativa da expressão gênica entre lagartas de S. frugiperda resistente e suscetível a lufenuron identificou 1.224 transcritos expressos diferencialmente (p <= 0,05, teste t; expressão relativa > 2). Sete destes transcritos foram associados ao metabolismo da cutícula, sendo cinco deles superexpressos na linhagem LUFR. O metabolismo de detoxificação apresentou 48 transcritos expressos diferencialmente, dos quais foram identificados 40 transcritos associados às monooxigenases P450, cinco a glutationa-S-transferase, dois às carboxilesterases e um a esterase. Foi observado que 39 dos 48 transcritos associados ao metabolismo de detoxificação foram superexpressos na linhagem resistente. Este padrão foi confirmado a partir da expressão relativa utilizando \"PCR quantitativa em Tempo Real - qPCR\". Estes resultados representam um importante passo para o entendimento dos mecanismos moleculares da resistência de S. frugiperda a lufenuron, proporcionando, ainda, uma visão mais ampla do perfil de expressão gênica de insetos a inseticidas. / The genetic and molecular basis of resistance to lufenuron in Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) were exploited in this study. The resistant population of S. frugiperda was selected from a population collected in Montevidiu, Goiás. Initially, a luferunon-resistant strain of S. frugiperda was selected from a population collected in cornfields located in Montevidiu, Goiás State, Brazil, with intense use of this insecticide. The diet surface treatment bioassay was used to characterize the concentration-response to lufenuron in the susceptible (SUS) and resistant (LUF-R) strains of S. frugiperda. The estimated LC50s (95% C.I.) for the SUS and LUF-R strains were 0.23 (0.18 - 0.28) and 210.6 (175.90 - 258.10) ?g of lufenuron.mL-1 respectively, with resistance ratio of ? 915-fold. Based on reciprocal crosses between SUS and LUF-R strains, the inheritance of S. frugiperda resistance to lufenuron was incomplete autosomal recessive. Backcrosses between F1 of the reciprocal crosses and the parental LUF-R revealed a polygenic resistance, with an estimation of the minimum number of resistance genes from 1.54 to 1.71, indicating that the number of loci associated to resistance is low. Then, a new high-throughput cDNA sequencing technologies was explored to characterize the transcriptional profile of larvae of Spodoptera frugiperda, and to compare the differential gene expression between resistant and susceptible strains of S. frugiperda to lufenuron in order to identify the resistance mechanism(s) involved. Four cDNA libraries obtained from fourth instars of the resistant (LUF-R) and the susceptible (SUS) S. frugiperda strains, exposed or not to lufenuron, were sequenced in a HiScan1000® platform (Illumina©). The transcriptome was de novo assembled using nearly 19.6 million single-end reads, leading to 18,506 transcripts with a N50 of 996 bp in length. A Blast search against the non-redundant database available in NCBI allowed the functional annotation of 51.1% (9,457) of the obtained transcripts. Most of these transcripts aligned with insect sequences, and a majority of them (45%) with Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae). Nearly 10% of the transcripts aligned with species belonging to Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), with 3% of the alignments matching sequences from Spodoptera frugiperda. Differential gene expression analysis between the resistant and the susceptible strains identified 1,224 differentially expressed transcripts (p <= 0.05, t-test; fold change > 2). Seven of them were associated with the cuticle metabolism, and five out seven were up-regulated in the resistant strain (LUF-R). A large set of transcripts (48) associated with the detoxification metabolism was differentially expressed; 40 P450 monooxygenases, five glutathione-Stransferases, two carboxylesterase and one esterase were identified. Thirty-nine out of these 48 transcripts were up-regulated in the resistant strain. Gene expression data obtained by RNA-Seq analysis was validated by quantitative real time PCR (qPCR) of several selected target transcripts. These results represent an important step toward the understanding of the molecular mechanisms of resistance of S. frugiperda to lufenuron, and provide a broader view on the gene expression profile of insects to insecticides.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04022014-095258 |
| Date | 23 January 2014 |
| Creators | Nascimento, Antonio Rogério Bezerra do |
| Contributors | Omoto, Celso |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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