Com o advento dos estudos moleculares evolutivos baseados nas sequências dos genes de RNAr 16S em cianobactérias, a taxonomia de Anabaena (Cyanobacteria) tem sido amplamente discutida e uma revisão deste gênero faz-se necessária. Os problemas variam desde o nível genérico, tal como o grupo Anabaena Aphanizomenon, até níveis de diferenciação de linhagens (morfoespécies). Estudos moleculares de linhagens de Anabaena isoladas de ecossistemas brasileiros são inexistentes. A fim de se explorar a diversidade, filogenia e diversificação evolutiva de Anabaena isoladas de ambientes brasileiros, estudos fenotípicos e genotípicos foram realizados no presente estudo. Um total de 43 isolados foram obtidos de corpos d´água do Estado de São Paulo (Reservatórios Billings, Santo Grande, Rio Piracicaba e Lago da ESALQ/USP (Engenharia) e do Estado do Ceará (Lagoa do Povoado Nova Aurora e Rio Camarão). As espécies de Anabaena isoladas foram identificadas como A. aphanizomenoides Forti, A. circinalis Rabenhorst ex Bornet et Flahault, A. crassa (Lemmermann) Komárková-Legnerová et Cronberg, A. cf. fallax Komárek et Komárková-Legnerová e A. planctonica Brunnthaler. Os meios de cultura usados no isolamento das cianobactérias foram AA/4, ASM-1 e BGN, este último também nas variantes com 50% de NaNO3 (BG50) e sem nitrato (BGS), com ou sem adição de vitamina B12. O meio ASM-1 não promoveu o crescimento de Anabaena. As espécies A. circinalis e A. crassa não cresceram no meio de culturaBGN com 17,65 mM de NaNO3, apresentando crescimento no meio BG50. A adição de vitamina B12 favoreceu o crescimento de A. circinalis. Os caracteres morfológicos analisados para 23 isolados foram o comprimento (compr) e diâmetro (diam) da célula vegetativa (V), heterócito (HT), acineto (AC), espira (ES), razões (R) comprimento/diâmetro para V, HT e AC e razão diâmetro/comprimento para ES (RES). O diâmetro da bainha (diamBA) foi também avaliado. As análises de componentes principais (ACP) confirmaram que a espira é uma característica importante para separar as morfoespécies A. circinalis, A.crassa e A. cf. fallax. RV e RHT foram diacríticos para diferenciação de A. cf. fallax. O comprimento do acineto (comprAC) foi importante para diferenciar A. aphanizomenoides de A. planctonica. A bainha diferenciou A. crassa das outras morfoespécies. As análises filogenéticas para o RNAr 16S mostraram os isolados brasileiros de A. circinalis, A. crassa, A. planctonica, A. aphanizomenoides e A. cf. fallax em agrupamentos separados, confirmando os resultados dos caracteres morfológicos. Com exceção da A. planctonica, as sequências de RNAr 16S dos isolados brasileiros não agruparam com linhagens relativas provenientes de outros países, indicando que elas são únicas. As análises filogenéticas dos genes RNAr 16S, rpoC1, rbcL, tufA concatenados corroboraram os resultados de filogenia do gene de RNAr 16S e as identificações morfológicas. A tentativa de obtenção de padrões moleculares para as espécies de Anabaena isoladas do Brasil foi feita utilizando a técnica de PCR-DGGE. Os fragmentos da região 359-781 do RNAr 16S apresentaram banda única para A. circinalis, enquanto que mais de uma banda foi verificado nas outras morfoespécies de Anabaena. / The advent of molecular evolutionary studies based on 16S rRNA genes sequences of cyanobacteria, the taxonomy of Anabaena (Cyanobacteria) has been widely discussed and a revision of the genus is required. The problems range from the generic level, such as Anabaena Aphanizomenon group, to levels of strains differentiation (morphospecies). Molecular studies of Anabaena strains isolated from Brazilian ecosystems are lacking. In order to explore the diversity, phylogeny and evolutionary diversification of Anabaena strains isolated from Brazilian environments, phenotypic and genotypic studies were performed. A total of 43 Anabaena isolates were obtained from water bodies of Sao Paulo State (Billings reservoir, Santo Grande reservoir, Piracicaba river and Engenharia pond Esalq) and Ceara State (Povoado Nova Aurora pond and Camarao river). The isolated Anabaena species were identified as A. aphanizomenoides Forti, A. circinalis Rabenhorst ex Bornet et Flahault, A. crassa (Lemmermann) Komárková-Legnerová et Cronberg, A. cf. fallax Lomárek et Komárková-Legnerová and A. planctonica Brunnthaler. The culture media used for cyanobacterial isolation were AA/4, ASM-1 andBGN, the latter also in the variants with NaNO3 50% (BG50) and without nitrate (BGS), with and without addition of B12 vitamin. The ASM-1 medium did not promote the growth of Anabaena. The A. circinalis and A. crassa species had not grown inBGN culture medium with NaNO3 17.65 mM, showing growth in BG50 medium. The addition of B12 vitamin favored the growth of A. circinalis. The morphological characters analyzed for 23 isolates were the length (L) and diameter (D) of vegetative cell (V), heterocyte (HT), akinete (AK), coil (CO), L/D ratio (R) for V, HT and AK, and D/L ratio for CO (RCO). The sheath diameter (SD) was also evaluated. The principal component analysis (PCA) confirmed that the coil is an important feature to separate the morphospecies A. circinalis, A.crassa and A. cf. fallax. RV and RHT were diacritical for differentiation of A. cf. fallax. The akinete length (LAK) was important to differentiate A. aphanizomenoides from A. planctonica. The sheath differentiated A. crassa from other morphospecies. Phylogenetic analyses of 16S rRNA gene placed A. circinalis and A. crassa, A. planctonica, A. aphanizomenoides and A. cf. fallax Brazilian isolates in separated clades in agreement with morphological characters. With the exception of A. planctonica, the 16S rRNA sequences of the Brazilian isolates did not cluster with relative strains originated from other countries, indicating that they are unique. The phylogenetic analysis of concatenated genes16S rRNA, rpoC1, rbcL, tufA corroborated results of 16S rRNA phylogeny and morphological identifications. The attempt to obtain molecular standards for the Anabaena species isolated from Brazil was made using the PCR-DGGE technique. The fragments of the 359-781 region of 16S rRNA showed only one DNA band for A. circinalis, while more than one band was observed in other Anabaena morphospecies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-24062009-085724 |
| Date | 07 May 2009 |
| Creators | Honda, Ricardo Yukio |
| Contributors | Fiore, Marli de Fatima |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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