Ο ρόλος του χαλκού είναι πολύ σημαντικός για τη σωστή λειτουργία της κυτοχρωμικής
c οξειδάσης (CcO), και συνεπώς για την κυτταρική αναπνοή στους ευκαρυωτικούς και
προκαρυωτικούς οργανισμούς. Η συγκρότηση της CcO στον ενδομεμβρανικό μιτοχονδριακό
χώρο είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, εξαρτώμενη από πλήθος συνεργών πρωτεϊνών,
υπεύθυνων για τη λειτουργική αναδίπλωση των υπομονάδων του ενζύμου και τη μεταφορά
αίμης και ιόντων Cu σε αυτές. Ενώ οι πρωτεΐνες που ενέχονται στη διαδικασία είναι μάλλον γνωστές, οι μηχανισμοί μεταφοράς και ενσωμάτωσης των μεταλλικών ιόντων στα δυο ενεργά
κέντρα της CcO, CuA και CuB, παραμένουν ανεξερεύνητοι. Το CuA κέντρο είναι ένα διπυρηνικό
κέντρο χαλκού, του οποίου ο ρόλος εντοπίζεται στη μεταφορά e- από το κυτόχρωμα c στο
καταλυτικό κέντρο CuB της CcO. Η σωστή συγκρότηση του CuA κέντρου είναι κρίσιμης
σημασίας για την καταλυτική δράση του ενζύμου. Αρκετές πρωτεΐνες έχουν χαρακτηριστεί σαν
ενεργοί παράγοντες στη μεταφορά ιόντων Cu στο CuA κέντρο, ο ακριβής, ωστόσο, μοριακός
μηχανισμός και ρόλος της κάθε πρωτεΐνης είναι άγνωστος. Στους προκαρυωτικούς
οργανισμούς, δυο οικογένειες πρωτεϊνών έχουν προταθεί για την εμπλοκή τους στη συγκρότηση
του CuA. Η πρώτη περιλαμβάνει πρωτεΐνες που δεσμεύουν ιόντα Cu1+ με ένα συντηρημένο
μοτίβο δέσμευσης H(M)x10Mx21HxM (υποθετικές πρωτεΐνες Hyp1) ενώ η δεύτερη περιλαμβάνει
τις πρωτεΐνες της οικογένειας Sco, των οποίων ο ρόλος στον μηχανισμό του CuA κέντρου σαν
θειορεδοξίνες ή χαλκομεταφορείς, παραμένει ασαφής.
Στην παρούσα εργασία αποδείχθηκε ότι μια νέα περιπλασματική πρωτεΐνη (TtHyp1 ή
PCuAC) εισάγει επιλεκτικά ιόντα Cu1+ στην Cox2 υπομονάδα της ba3-CcO του Thermus
thermophilus προς σχηματισμό του φυσιολογικού διπυρηνικού TtCuA κέντρου, καθώς και ότι η
Sco πρωτεΐνη του συγκεκριμένου οργανισμού (TtSco1) δεν μεταφέρει μεταλλικά ιόντα στο CuA,
αλλά δρα σαν θειο-δισουλφιδική αναγωγάση ρυθμίζοντας τη σωστή οξειδωτική κατάσταση των
κυστεϊνικών καταλοίπων του CuA. Οι πρωτεΐνες PCuAC, TtSco1 και TtCuA εκφράστηκαν,
απομονώθηκαν και μελετήθηκαν τα βιοχημικά χαρακτηριστικά τους, η ικανότητα δέσμευσης
μεταλλικών ιόντων και οι μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις. Επιπλέον η PCuAC χαρακτηρίστηκε
δομικά με φασματοσκοπία NMR στην απο και Cu(I) μορφή της. Ο ρόλος των προκαρυωτικών
Sco διερευνήθηκε περαιτέρω με μελέτες γονιδιακής ανάλυσης και την έκφραση και τον
προκαταρκτικό χαρακτηρισμό μιας νέας πρωτεΐνης, PpSco1/cytc της Pseudomonas putida,
πρωτεΐνης αποτελούμενης από δυο επικράτειες, Sco1 και cytc, συνδέοντας το ρόλο των Sco
πρωτεϊνών με τη θεωρια περί θειρεδοξινικής τους δράσης.
Καινοτομία στην παρούσα εργασία αποτέλεσε η μεθοδολογική προσέγγιση της
πολλαπλής κλωνοποίησης των γονιδίων-στόχων με μια νέα τεχνολογία κλωνοποίησης (Gateway)
συνδυασμένης με τοποειδική ένθεση σε πολλαπλούς πλασμιδιακούς φορείς και η ανάπτυξη
high throughput τεχνικών για πολλαπλές δοκιμές έκφρασης – απομόνωσης.
Η συγκεκριμένη μελέτη παρέχει νέα δεδομένα για το μηχανισμό τη συγκρότησης του
CuA κέντρου της προκαρυωτικής CcO, υποστηρίζοντας ένα νέο μοντέλο για τη συγκεκριμένη
διαδικασία και παράλληλα συνδράμει στην αποκρυπτογράφηση του πολύπλοκου ρόλου των
Sco πρωτεϊνών. / Copper is essential for the correct assembly and function of the cytochrome c oxidase
(CcO), thus for the efficient cellular respiration in both eukaryotes and prokaryotes. CcO
assembly in the inner mitochondrial membrane space is a multi complicated procedure,
depended on a number of co-factors and their synergic action. These co-factors are proteins
commissioned with the correct folding of the enzyme subunits and the
transport/incorporation of heme moieties and Cu ions to them.
While the proteins involved in this multistep procedure are rather known, the
mechanisms of metal ion delivery and incorporation within the two active centers of CcO,
CuA and CuB, still remain uncharted. The CuA center is a binuclear copper center, whose
part in the respiratory chain is spoted in electron transport from the active cytochrome c to
the catalytic CuB center of CcO. Efficient CuA assembly is crucial for the catalytic action of
the entire enzyme. Several proteins have been characterized as essential factors for the
transport of Cu ions to the CuA center; however their exact molecular mechanism of action
still remains obscure.
In prokaryotes, two protein families have been suggested to be involved in the CuA
assembly.
The first includes proteins that bind Cu1+ ions through a potential conserved motif
H(M)x10Mx21HxM (hypothetical proteins, Hyp1), while the second includes proteins of the
Sco family, whose exact role in CuA assembly as thioredoxins or copper chaperones is
widely debated.
In this work, it is propesed that a new periplasmic protein (TtHyp1 or PCuAC)
selectively inserts Cu1+ ions in the Cox2 subunit of the ba3-CcO of Thermus thermophilus
resulting the formation of the physiological binuclear TtCuA center, as well as that the Sco
protein of the organism (TtSco1) is not able to transfer metal ions to the CuA center; instead
it acts rather like a thio-disulfide reductase adjusting the proper redox state of the CuA
cysteine residues. Proteins PCuAC, TtSco1 and TtCuA were over-expressed, purified and
subjected to biochemical characterization, while their Cu binding capability and their inter
se interactions were studied through NMR and UV spectroscopy. In addition, PCuAC was
structurally characterized through NMR in its apo and Cu(I) form. The role of Sco proteins
was further investigated through genome based analysis and the expression and
biochemical characterization of a new protein, PpSco1/cytc from Pseudomonas putida, a
unique bacterial protein consisted on two domains, a Sco1 and a cytc domain,
presumptively connecting the role of Sco proteins with the suggested theory of thioredoxin
action.
A novelty in this work was the methodological aspect of the multiple cloning of the
target genes with a new cloning technology (Gateway) combined with site specific
recombination into multiple expression plasmid vectors and the development of a high
throughput technique for parallel expression/purification tests.
The infra work provides new insights to the CuA center assembly molecular
mechanism of the prokaryotic CcO, supporting a new model for the particular procedure
and also subscripts for the decipherment of the complicated role of Sco proteins.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/1321 |
| Date | 09 February 2009 |
| Creators | Γκαζώνης, Πέτρος |
| Contributors | Σπυρούλιας, Γεώργιος, Gkazonis, Petros, Τζάρτος, Σωκράτης, Παπαδημητρίου, Ευαγγελία, Σπυρούλιας, Γεώργιος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0097 seconds