Spelling suggestions: "subject:"μιτοχόνδριο"" "subject:"μιτοχόνδρια""
1 |
Μοριακή φυλογένεια πληθυσμών της Atherina boyeriΚράιτσεκ, Σπυριδούλα 07 October 2011 (has links)
Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η γενετική δομή και οι φυλογενετικές
σχέσεις είκοσι τριών πληθυσμών της A.boyeri που προέρχονταν από
λίμνες/λιμνοθάλασσες και θαλάσσιες περιοχές του ελλαδικού χώρου, καθώς
και ενός πληθυσμού από τη λίμνη Iznik της Τουρκίας. Πιο συγκεκριμένα,
προσδιορίστηκε μέρος της αλληλουχίας των μιτοχονδριακών γενετικών τόπων
της υπομονάδας I της κυτοχρωματικής οξειδάσης (COI), του βρόγχου εκτόπισης
(D-loop) και του κυτοχρώματος b (Cytb). Επιπλέον, προσδιορίστηκε η
αλληλουχία ενός πυρηνικού γενετικού τόπου, της ροδοψίνης (Rh).
Πραγματοποιήθηκε φυλογενετική ανάλυση των αλληλουχιών και
κατασκευάστηκαν φυλογενετικά δένδρα με τις μεθόδους της Σύνδεσης Γειτόνων
(NJ), Μέγιστης Φειδωλότητας (ΜΡ) και Μπεϊσιανής Συμπερασματολογίας (ΒΙ).
Παρά τη διαφορετική τοπολογία των δένδρων που προέκυψαν, γεγονός
που δεν κατέστησε εφικτό τον προσδιορισμό των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ
των υπό μελέτη πληθυσμών, η ύπαρξη τριών διαφορετικών τύπων πληθυσμών
διαπιστώθηκε τόσο από την ανεξάρτητη όσο και από τη συνδυασμένη ανάλυση
των αλληλουχιών. Ο πρώτος τύπος πληθυσμού, ο «λιμναίος», περιελάμβανε
τους πληθυσμούς από τις λίμνες/λιμνοθάλασσες καθώς και τους πληθυσμούς
από τις θαλάσσιες περιοχές της Καλύμνου, της Κύμης και των Ν. Μουδανιών. Ο
δεύτερος τύπος περιελάμβανε όλους τους θαλάσσιους πληθυσμούς (πρώτος
«θαλάσσιος» τύπος), με εξαίρεση του πληθυσμούς από την Πρέβεζα, την Εύβοια
και την Κω που συνιστούσαν τον τρίτο τύπο πληθυσμού (δεύτερος «θαλάσσιος»
τύπος). Επισημαίνεται ιδιαίτερα ότι ο πυρηνικός μοριακός δείκτης που
χρησιμοποιήθηκε έφερε αρκετή ποικιλότητα ώστε να επιβεβαιώσει τα
παραπάνω αποτελέσματα.
Οι «λιμναίοι» πληθυσμοί εμφάνισαν σαφές φυλογεωγραφικό πρότυπο,
διακρίνοντας τους πληθυσμούς του Αιγαίου και της Τουρκίας από τους
λιμναίους/λιμνοθαλάσσιους του Ιονίου Πελάγους. Επιπλέον, διαπιστώθηκε πως
ο πληθυσμός από τον Αμβρακικό διαφοροποιείται αρκετά από τους υπόλοιπους
«λιμναίους» πληθυσμούς, ενώ αξιοσημείωτη είναι και η συσχέτιση που βρέθηκε
ανάμεσα σε αυτόν τον πληθυσμό και πληθυσμών από την Αδριατική.
Όσον αφορά τους θαλάσσιους πληθυσμούς, κανένας από τους δύο
τύπους δεν εμφάνισε συγκεκριμένο φυλογεωγραφικό πρότυπο. Επιπλέον,
διαπιστώθηκε πως οι πληθυσμοί από την Πρέβεζα, την Εύβοια και την Κω
αντιστοιχούν στον εστιγμένο (punctuated) τύπο πληθυσμού, όπως έχει
περιγραφεί, ο οποίος δεν έχει έως σήμερα αναφερθεί στην ανατολική Μεσόγειο.
Ωστόσο, σύμφωνα με τα αποτελέσματα μας, τα μαύρα στίγματα κάτω από την
πλευρική γραμμή δεν μπορούν να αποτελέσουν διαγνωστικό στοιχείο για τη
διάκριση των δύο τύπων θαλάσσιων πληθυσμών (punctuated, nonpunctuated),
καθώς στον τύπο αυτό εντάσσονται άτομα που είτε φέρουν μαύρα
στίγματα είτε όχι, και το αντίστροφο.
Από τον πολλαπλασιασμό με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης
πολυμεράσης (PCR) του μιτοχονδριακού τμήματος Cytb και τον προσδιορισμό
της αλληλουχίας του, διαπιστώθηκε η ύπαρξη μίας ένθεσης ανάμεσα στο tRNA
του γλουταμινικού οξέος και το Cytb. Η ένθεση αυτή είχε μέγεθος περίπου
200bp στα «λιμναία» άτομα και λίγο μικρότερο (~150bp) στα άτομα που
εμφάνισαν το πρότυπο punctuated (εστιγμένα) (Πρέβεζα, Εύβοια, Κως), ενώ
απουσίαζε από τους υπόλοιπους θαλάσσιους πληθυσμούς.
Βάσει των παρόντων αποτελεσμάτων και σε συνδυασμό με αντίστοιχα
αποτελέσματα προηγούμενων μελετών επιβεβαιώνεται η άποψη σύμφωνα με
την οποία η παρουσία ή απουσία της συγκεκριμένης ένθεσης μπορεί να
χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικός χαρακτήρας για τη διάκριση των τριών
διαφορετικών τύπων πληθυσμών της A.boyeri. / The genetic differentiation and the phylogenetic relationships of
twenty three Atherina boyeri populations originating from lakes/lagoons and
marine sites of Greece, as well as from a population from lake Iznik in
Turkey were investigated. More specifically, the partial sequence of the
mitochondrial genes cytochrome oxidase I (COI), cytochrome b (cytb) and
control region were determined. The partial sequence of the nuclear proteincoding
gene rhodopsin (Rh) was determined, as well. Phylogenetic analysis of
the sequences was conducted using the methods: Neighbor-Joining (NJ),
Maximum Parsimony (MP) and Bayesian Inference (BI).
Even though trees presented different topologies, and thus the
phylogenetic relationships among populations were not able to be resolved,
the presence of three main population forms was observed both from the
separate and combined analyses of datasets. The first population type
(‘lagoon’ type) contains all the lagoon/lake populations, as well as three
populations (Kymi, Kalymnos and Nea Moudania) originating from marine
environment. The second type includes nearly all marine populations (first
‘marine’ type), excluding specimens collected from three geographical distant
areas (Preveza, Evvoia and Kos), which form the third A. boyeri population
type (second ‘marine’ type). It is worth mentioning that the nuclear marker
used was proved to carry sufficient diversity in order to confirm the above
results.
The ‘lagoon’ type populations presented a clear phylogeographic
pattern, with the populations from Aegean Sea and Turkey forming a distinct
group from the populations from the Ionian Sea. Moreover, the population
from Amvrakikos appeared to be distinct from the rest ‘lagoon’ type
populations and a remarkable correlation of this population and populations
from Adriatic Sea was found.
On the other hand, none of the two ‘marine’ type populations
presented a specific phylogeographic pattern. Additionally, it was found that
the populations from Preveza, Evvoia and Kos correspond to the ‘punctuated’
marine type, as has been described, which was not previously reported in
eastern Mediterranean Sea. However, the fact that in the present study a
population (Evvoia) without black spots on the flanks is clustered with the
punctuated form and vice versa (specimens from Limnos presented black
spots but was clustered with the non-punctuated ‘marine’ type populations),
suggests that differences in color pattern do not seem to be a sufficient
marker for discriminating the two marine types.
From the PCR amplification of cytb and determination of its sequence
the presence of approximately 200bp intergenic spacer between tRNA
glutamic acid (tRNAGlu) and cyt b genes was observed among the ‘lagoon’
type specimens and a smaller one among the specimens from Preveza,
Evvoia and Kos. The intergenic spacer was absent from the rest marine populations. Thus, our results support the suggestion that this character is
conserved and capable to be used for distinguishing the different forms.
|
2 |
Έκφραση και χαρακτηρισμός ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών μεταφοράς χαλκού για τη μελέτη της συνεργικής τους δράσης κατά το τελευταίο στάδιο της αναπνευστικής αλυσίδας του μιτοχονδρίου / Expression and characterization of recombinant copper chaperones for the study of their synergic action in the final step of mitochondrial respiratory chain.Γκαζώνης, Πέτρος 09 February 2009 (has links)
Ο ρόλος του χαλκού είναι πολύ σημαντικός για τη σωστή λειτουργία της κυτοχρωμικής
c οξειδάσης (CcO), και συνεπώς για την κυτταρική αναπνοή στους ευκαρυωτικούς και
προκαρυωτικούς οργανισμούς. Η συγκρότηση της CcO στον ενδομεμβρανικό μιτοχονδριακό
χώρο είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, εξαρτώμενη από πλήθος συνεργών πρωτεϊνών,
υπεύθυνων για τη λειτουργική αναδίπλωση των υπομονάδων του ενζύμου και τη μεταφορά
αίμης και ιόντων Cu σε αυτές. Ενώ οι πρωτεΐνες που ενέχονται στη διαδικασία είναι μάλλον γνωστές, οι μηχανισμοί μεταφοράς και ενσωμάτωσης των μεταλλικών ιόντων στα δυο ενεργά
κέντρα της CcO, CuA και CuB, παραμένουν ανεξερεύνητοι. Το CuA κέντρο είναι ένα διπυρηνικό
κέντρο χαλκού, του οποίου ο ρόλος εντοπίζεται στη μεταφορά e- από το κυτόχρωμα c στο
καταλυτικό κέντρο CuB της CcO. Η σωστή συγκρότηση του CuA κέντρου είναι κρίσιμης
σημασίας για την καταλυτική δράση του ενζύμου. Αρκετές πρωτεΐνες έχουν χαρακτηριστεί σαν
ενεργοί παράγοντες στη μεταφορά ιόντων Cu στο CuA κέντρο, ο ακριβής, ωστόσο, μοριακός
μηχανισμός και ρόλος της κάθε πρωτεΐνης είναι άγνωστος. Στους προκαρυωτικούς
οργανισμούς, δυο οικογένειες πρωτεϊνών έχουν προταθεί για την εμπλοκή τους στη συγκρότηση
του CuA. Η πρώτη περιλαμβάνει πρωτεΐνες που δεσμεύουν ιόντα Cu1+ με ένα συντηρημένο
μοτίβο δέσμευσης H(M)x10Mx21HxM (υποθετικές πρωτεΐνες Hyp1) ενώ η δεύτερη περιλαμβάνει
τις πρωτεΐνες της οικογένειας Sco, των οποίων ο ρόλος στον μηχανισμό του CuA κέντρου σαν
θειορεδοξίνες ή χαλκομεταφορείς, παραμένει ασαφής.
Στην παρούσα εργασία αποδείχθηκε ότι μια νέα περιπλασματική πρωτεΐνη (TtHyp1 ή
PCuAC) εισάγει επιλεκτικά ιόντα Cu1+ στην Cox2 υπομονάδα της ba3-CcO του Thermus
thermophilus προς σχηματισμό του φυσιολογικού διπυρηνικού TtCuA κέντρου, καθώς και ότι η
Sco πρωτεΐνη του συγκεκριμένου οργανισμού (TtSco1) δεν μεταφέρει μεταλλικά ιόντα στο CuA,
αλλά δρα σαν θειο-δισουλφιδική αναγωγάση ρυθμίζοντας τη σωστή οξειδωτική κατάσταση των
κυστεϊνικών καταλοίπων του CuA. Οι πρωτεΐνες PCuAC, TtSco1 και TtCuA εκφράστηκαν,
απομονώθηκαν και μελετήθηκαν τα βιοχημικά χαρακτηριστικά τους, η ικανότητα δέσμευσης
μεταλλικών ιόντων και οι μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις. Επιπλέον η PCuAC χαρακτηρίστηκε
δομικά με φασματοσκοπία NMR στην απο και Cu(I) μορφή της. Ο ρόλος των προκαρυωτικών
Sco διερευνήθηκε περαιτέρω με μελέτες γονιδιακής ανάλυσης και την έκφραση και τον
προκαταρκτικό χαρακτηρισμό μιας νέας πρωτεΐνης, PpSco1/cytc της Pseudomonas putida,
πρωτεΐνης αποτελούμενης από δυο επικράτειες, Sco1 και cytc, συνδέοντας το ρόλο των Sco
πρωτεϊνών με τη θεωρια περί θειρεδοξινικής τους δράσης.
Καινοτομία στην παρούσα εργασία αποτέλεσε η μεθοδολογική προσέγγιση της
πολλαπλής κλωνοποίησης των γονιδίων-στόχων με μια νέα τεχνολογία κλωνοποίησης (Gateway)
συνδυασμένης με τοποειδική ένθεση σε πολλαπλούς πλασμιδιακούς φορείς και η ανάπτυξη
high throughput τεχνικών για πολλαπλές δοκιμές έκφρασης – απομόνωσης.
Η συγκεκριμένη μελέτη παρέχει νέα δεδομένα για το μηχανισμό τη συγκρότησης του
CuA κέντρου της προκαρυωτικής CcO, υποστηρίζοντας ένα νέο μοντέλο για τη συγκεκριμένη
διαδικασία και παράλληλα συνδράμει στην αποκρυπτογράφηση του πολύπλοκου ρόλου των
Sco πρωτεϊνών. / Copper is essential for the correct assembly and function of the cytochrome c oxidase
(CcO), thus for the efficient cellular respiration in both eukaryotes and prokaryotes. CcO
assembly in the inner mitochondrial membrane space is a multi complicated procedure,
depended on a number of co-factors and their synergic action. These co-factors are proteins
commissioned with the correct folding of the enzyme subunits and the
transport/incorporation of heme moieties and Cu ions to them.
While the proteins involved in this multistep procedure are rather known, the
mechanisms of metal ion delivery and incorporation within the two active centers of CcO,
CuA and CuB, still remain uncharted. The CuA center is a binuclear copper center, whose
part in the respiratory chain is spoted in electron transport from the active cytochrome c to
the catalytic CuB center of CcO. Efficient CuA assembly is crucial for the catalytic action of
the entire enzyme. Several proteins have been characterized as essential factors for the
transport of Cu ions to the CuA center; however their exact molecular mechanism of action
still remains obscure.
In prokaryotes, two protein families have been suggested to be involved in the CuA
assembly.
The first includes proteins that bind Cu1+ ions through a potential conserved motif
H(M)x10Mx21HxM (hypothetical proteins, Hyp1), while the second includes proteins of the
Sco family, whose exact role in CuA assembly as thioredoxins or copper chaperones is
widely debated.
In this work, it is propesed that a new periplasmic protein (TtHyp1 or PCuAC)
selectively inserts Cu1+ ions in the Cox2 subunit of the ba3-CcO of Thermus thermophilus
resulting the formation of the physiological binuclear TtCuA center, as well as that the Sco
protein of the organism (TtSco1) is not able to transfer metal ions to the CuA center; instead
it acts rather like a thio-disulfide reductase adjusting the proper redox state of the CuA
cysteine residues. Proteins PCuAC, TtSco1 and TtCuA were over-expressed, purified and
subjected to biochemical characterization, while their Cu binding capability and their inter
se interactions were studied through NMR and UV spectroscopy. In addition, PCuAC was
structurally characterized through NMR in its apo and Cu(I) form. The role of Sco proteins
was further investigated through genome based analysis and the expression and
biochemical characterization of a new protein, PpSco1/cytc from Pseudomonas putida, a
unique bacterial protein consisted on two domains, a Sco1 and a cytc domain,
presumptively connecting the role of Sco proteins with the suggested theory of thioredoxin
action.
A novelty in this work was the methodological aspect of the multiple cloning of the
target genes with a new cloning technology (Gateway) combined with site specific
recombination into multiple expression plasmid vectors and the development of a high
throughput technique for parallel expression/purification tests.
The infra work provides new insights to the CuA center assembly molecular
mechanism of the prokaryotic CcO, supporting a new model for the particular procedure
and also subscripts for the decipherment of the complicated role of Sco proteins.
|
Page generated in 0.0162 seconds