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Previous issue date: 2008-04-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / In this work, several strategies were tested to improve the covalent multipoint attachment of chymotrypsin, carboxypeptidase A and cellulase on chitosan. Hybrid gels with different internal structures were obtained using sodium alginate, gelatin or κ-carrageenan and by changing the polymer concentration, 2.5-5.0% (m/v) and the activating reactant, glutaraldehyde, glycidol or epichlorohydrin. The addition of microorganisms to the hybrid polymer followed by cellular lysis, the increase of immobilization reaction time and the effect of the reduction of the final derivative with sodium borohydride were also tested. The influence of these variables on immobilization yields, recovered activities, and stabilization factors at 55°C and 65°C, were assessed. Chymotrypsin derivatives half-lives increased from 34 min at 55°C (for pure chitosan 2.5% activated with glutaraldehyde at pH 7.0, 4°C) to 468 min at 65°C (for chitosan 2.5%-carrageenan 2.5%, with the addition of 5% of S.cerevisiae, activation with epichlorohydrin, immobilization for 72 h at pH 10.05, room temperature and reduction of the final derivative). This best derivative was 9900-fold more stable than the soluble enzyme. A maximum load of 40 mg chymotrypsin.g.gel-1 was reached. The number of aldehyde and oxirane groups generated in the support, and of lysine residues of the enzyme involved in the multipoint attachment, as well SEM images of the gel structures, explain the obtained results. Carboxypeptidase A derivatives was analyzed. The results showed that immobilization via epichlorohydrin presented 40% (8.8) more stable derivatives than glutaraldehyde ones (5.3). However, derivative prepared with epoxides groups presented 100% of immobilization yield with 57% of recovered activity being 20-fold more stable than free enzyme after 48h of immobilization process. Derivatives activated by glutaraldehyde, epichlorohydrin and with epoxides presented diffusion limitations with Deff of 5.41.10-12, 5.59.10-12 m2.s-1 and 5.10.10-12 m2.s-1, respectively. To cellulase, assays of immobilization and saccharification of sugarcane bagasse cane were tested. The derivative used in a sequence of three distinct batches, was prepared with chitosan-alginate activated with glutaraldehyde/glycidol being 20-fold more stable than free enzyme. The best enzyme derivative was about 38 fold more stable activated via glycidol. The performance of the system of saccharification was excellent, indicating that enzyme immobilization may be a good alternative to reduce costs of ethanol production from lignocellulosic materials. / Neste trabalho de tese, várias estratégias foram analisadas com objetivo de melhorar e promover uma imobilização covalente multipontual de quimotripsina, carboxipeptidase A e celulase em quitosana. Géis híbridos com diferentes estruturas internas foram obtidos usando alginato de sódio, gelatina e κ-carragenana, bem como, variando a concentração de polímeros, 2,5-5,0% (m/v) e os agentes de ativação (glutaraldeído, glicidol e epicloridrina). A adição de células aos híbridos, seguido de lise celular, o aumento no tempo de imobilização e o efeito da redução no derivado final por borohidreto de sódio foram investigados. Foram averiguadas a influência destas variáveis nos rendimentos de imobilização, atividades recuperadas e estabilização a 55ºC e 65ºC. Derivados de quimotripsina tiveram um incremento de estabilidade de 34 min a 55ºC (para quitosana pura 2,5% ativada com glutaraldeído a pH 7,0 e a 4ºC) para 468 min a 65ºC (para quitosana 2,5%-carragenana 2,5% com adição de 5% de S.cerevisiae e ativado com epicloridrina com tempo de imobilização de 72h a pH 10,05 a 25ºC e reduzido). Este melhor derivado foi 9900 vezes mais estável que a enzima livre. A máxima capacidade de imobilização foi de 40 mg de quimotripsina g.gel-1. O número de grupos aldeídos e oxiranos gerados no suporte e a quantidade de lisina envolvidas na imobilização multipontual, bem como as imagens do MEV das estruturas dos suportes explicam os resultados obtidos. Derivados de carboxipeptidase A quando ativado com glutaraldeído mostrou uma melhor estabilização de 5,3 vezes, já para o ativado com epicloridrina foi de 8,8 vezes. Entretanto, o derivado preparado com grupos oxiranos apresentou 100% de rendimento de imobilização com recuperação de atividade de 57% e foi 20 vezes mais estável que a enzima livre a 55ºC com tempo de imobilização de 48h e bloqueio de grupos epóxidos com glicina. Os derivados ativados com glutaraldeído, epicloridrina e epoxilado apresentaram sérias limitações difusionais na hidrólise de hipuril-Lfenilalanina com Deff de 5,41.10-12 , 5,59.10-12 m2.s-1 e 5,10.10-12 m2.s-1, respectivamente. Ensaios de imobilização da celulase e sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar foram realizados concomitantemente. O derivado utilizado em uma seqüência de três bateladas foi obtido com quitosana-alginato ativado com glutaraldeído/glicidol sendo este derivado 20 vezes mais estável que a enzima livre. Entretanto o melhor derivado obtido nos ensaios de imobilização foi com ativação de glicidol com uma estabilidade de aproximadamente 38 vezes seguido da imobilização por encapsulação seguido de reticulação com glutaraldeído com um fator de estabilidade de aproximadamente 33 vezes em relação à livre. O desempenho do sistema de sacarificação foi muito bom, indicando a reusabilidade da celulase imobilizada é uma boa alternativa para reduzir custos na produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/3859 |
| Date | 25 April 2008 |
| Creators | Adriano, Wellington Sabino |
| Contributors | Giordano, Raquel de Lima Camargo |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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