Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1875.pdf: 2067578 bytes, checksum: 8ff948a97c937ef826fb4b4274b1c998 (MD5) Previous issue date: 2008-04-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / In this work, several strategies were tested to improve the covalent multipoint attachment of chymotrypsin, carboxypeptidase A and cellulase on chitosan. Hybrid gels with different internal structures were obtained using sodium alginate, gelatin or κ-carrageenan and by changing the polymer concentration, 2.5-5.0% (m/v) and the activating reactant, glutaraldehyde, glycidol or epichlorohydrin. The addition of microorganisms to the hybrid polymer followed by cellular lysis, the increase of immobilization reaction time and the effect of the reduction of the final derivative with sodium borohydride were also tested. The influence of these variables on immobilization yields, recovered activities, and stabilization factors at 55°C and 65°C, were assessed. Chymotrypsin derivatives half-lives increased from 34 min at 55°C (for pure chitosan 2.5% activated with glutaraldehyde at pH 7.0, 4°C) to 468 min at 65°C (for chitosan 2.5%-carrageenan 2.5%, with the addition of 5% of S.cerevisiae, activation with epichlorohydrin, immobilization for 72 h at pH 10.05, room temperature and reduction of the final derivative). This best derivative was 9900-fold more stable than the soluble enzyme. A maximum load of 40 mg chymotrypsin.g.gel-1 was reached. The number of aldehyde and oxirane groups generated in the support, and of lysine residues of the enzyme involved in the multipoint attachment, as well SEM images of the gel structures, explain the obtained results. Carboxypeptidase A derivatives was analyzed. The results showed that immobilization via epichlorohydrin presented 40% (8.8) more stable derivatives than glutaraldehyde ones (5.3). However, derivative prepared with epoxides groups presented 100% of immobilization yield with 57% of recovered activity being 20-fold more stable than free enzyme after 48h of immobilization process. Derivatives activated by glutaraldehyde, epichlorohydrin and with epoxides presented diffusion limitations with Deff of 5.41.10-12, 5.59.10-12 m2.s-1 and 5.10.10-12 m2.s-1, respectively. To cellulase, assays of immobilization and saccharification of sugarcane bagasse cane were tested. The derivative used in a sequence of three distinct batches, was prepared with chitosan-alginate activated with glutaraldehyde/glycidol being 20-fold more stable than free enzyme. The best enzyme derivative was about 38 fold more stable activated via glycidol. The performance of the system of saccharification was excellent, indicating that enzyme immobilization may be a good alternative to reduce costs of ethanol production from lignocellulosic materials. / Neste trabalho de tese, várias estratégias foram analisadas com objetivo de melhorar e promover uma imobilização covalente multipontual de quimotripsina, carboxipeptidase A e celulase em quitosana. Géis híbridos com diferentes estruturas internas foram obtidos usando alginato de sódio, gelatina e κ-carragenana, bem como, variando a concentração de polímeros, 2,5-5,0% (m/v) e os agentes de ativação (glutaraldeído, glicidol e epicloridrina). A adição de células aos híbridos, seguido de lise celular, o aumento no tempo de imobilização e o efeito da redução no derivado final por borohidreto de sódio foram investigados. Foram averiguadas a influência destas variáveis nos rendimentos de imobilização, atividades recuperadas e estabilização a 55ºC e 65ºC. Derivados de quimotripsina tiveram um incremento de estabilidade de 34 min a 55ºC (para quitosana pura 2,5% ativada com glutaraldeído a pH 7,0 e a 4ºC) para 468 min a 65ºC (para quitosana 2,5%-carragenana 2,5% com adição de 5% de S.cerevisiae e ativado com epicloridrina com tempo de imobilização de 72h a pH 10,05 a 25ºC e reduzido). Este melhor derivado foi 9900 vezes mais estável que a enzima livre. A máxima capacidade de imobilização foi de 40 mg de quimotripsina g.gel-1. O número de grupos aldeídos e oxiranos gerados no suporte e a quantidade de lisina envolvidas na imobilização multipontual, bem como as imagens do MEV das estruturas dos suportes explicam os resultados obtidos. Derivados de carboxipeptidase A quando ativado com glutaraldeído mostrou uma melhor estabilização de 5,3 vezes, já para o ativado com epicloridrina foi de 8,8 vezes. Entretanto, o derivado preparado com grupos oxiranos apresentou 100% de rendimento de imobilização com recuperação de atividade de 57% e foi 20 vezes mais estável que a enzima livre a 55ºC com tempo de imobilização de 48h e bloqueio de grupos epóxidos com glicina. Os derivados ativados com glutaraldeído, epicloridrina e epoxilado apresentaram sérias limitações difusionais na hidrólise de hipuril-Lfenilalanina com Deff de 5,41.10-12 , 5,59.10-12 m2.s-1 e 5,10.10-12 m2.s-1, respectivamente. Ensaios de imobilização da celulase e sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar foram realizados concomitantemente. O derivado utilizado em uma seqüência de três bateladas foi obtido com quitosana-alginato ativado com glutaraldeído/glicidol sendo este derivado 20 vezes mais estável que a enzima livre. Entretanto o melhor derivado obtido nos ensaios de imobilização foi com ativação de glicidol com uma estabilidade de aproximadamente 38 vezes seguido da imobilização por encapsulação seguido de reticulação com glutaraldeído com um fator de estabilidade de aproximadamente 33 vezes em relação à livre. O desempenho do sistema de sacarificação foi muito bom, indicando a reusabilidade da celulase imobilizada é uma boa alternativa para reduzir custos na produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DoutPWT.pdf: 1538718 bytes, checksum: a2cfebb6aac530f7f09069137eaebc60 (MD5) Previous issue date: 2003-08-22 / Universidade Federal de Minas Gerais / High value food protein hydrolysates can be obtained by sequential hydrolysis of proteins with trypsin, chymotrypsin, carboxypeptidase A (CPA) and Alcalase® (commercial preparation of subtilisin). For the process to be economically feasible, immobilized and stabilized enzymes should be used, and the kinetics of the reactions with this kind of biocatalyst must be known. To contribute to the development of such a process, this work focused on preparing stable CPA and Alcalase® derivatives, and on studying the kinetics of hydrolysis of polypeptides. These polypeptides were produced after the sequential hydrolysis of cheese whey proteins with trypsin and chymotrypsin. Cross-linked agarose beads (6% w/w for CPA, and 10% w/w for Alcalase®) were used as immobilization support, and different methods of activation and immobilization conditions were studied. A highly activated glyoxyl-agarose support (75 and 210 µeqv of aldehyde groups per milliliter of support, respectively for CPA and Alcalase®), 25oC, pH 10.05, and longer contact time (48 hours for CPA and 96 hours for Alcalase®), provided the best derivatives. CPA-glyoxyl agarose-6% and Alcalase®-glyoxyl agarose-10% derivatives were ca. 213- and 515-fold more stable than the soluble enzymes. These stabilized derivatives retained 42% (for CPA-glyoxyl agarose- 6%) and 54% (for Alcalase®-glyoxyl agarose-10%) of the immobilized activity, assessed with small substrates (hippuryl-L-Phe for CPA, and Boc-Ala-ONp for Alcalase®) and large substrates (Phe carboxy-terminal polypeptides for CPA, and casein for Alcalase®). These results showed that all activity losses were caused by the distortion of the immobilized enzyme molecule, due to the enzyme-support multi-interaction. Derivatives prepared using glutaraldehyde-agarose presented spatial hindrances when hydrolysis of macromolecular substrates was taking place. The amino acid analysis of acid hydrolysates of the soluble and immobilized enzymes (for the more stable derivatives) showed that ca. 30 and 40%, for CPA and Alcalase®, of the lysine residues were linked to the support, suggesting that there is intense multi-point interactions between enzyme and support, through covalent linkages. The temperatures for maximum hydrolysis rates, using respectively stabilized CPA and Alcalase® derivatives, were 20oC and 10oC higher than the ones obtained using soluble enzymes. The most stable CPA-glyoxyl derivative could efficiently be used for polypeptides (cheese whey proteins hydrolyzed with trypsin and chymotrypsin) hydrolysis at high temperatures (e.g., 60oC), releasing ca. 2-fold more aromatic amino acids (Tyr, Phe and Trp) than the soluble enzyme, under the same operational conditions. The casein degree of hydrolysis, at 80oC, obtained using the most stable Alcalase®-glyoxyl derivative, was 2-fold higher than the one obtained with the soluble enzyme. Hence, the produced derivatives allow the design of a continuous process for the production of protein hydrolysates, which are composed of small peptides and have a low concentration of aromatic amino acids. This process can use higher temperature, avoiding microbial growth in the reaction medium. The C-terminal residues hydrolysis at 45oC (pH 7.0), catalyzed by CPA-glyoxyl, could be adequately represented by Michaelis-Menten kinetics, with substrate and product inhibition. The kinetic model was expressed in terms of C-terminal peptide bonds that can be hydrolyzed by CPA, regardless of the amino acid released. The concentration of each released amino acid as a function of the time of reaction could be well fitted by empirical models (hyperbolic or exponential decay). Hence, from the kinetics of total hydrolysis, it is possible to estimate the concentration of each amino acid as function of time. The hydrolysis catalyzed by the highly-loaded CPA-glyoxyl agarose-6% derivative was not limited by intra-particle diffusion resistance. The hydrolysis of peptides (long-time batch) at 50oC (pH 9.5), catalyzed by Alcalase®-glyoxyl agarose-10% derivative, could be adequately represented by Michaelis-Menten kinetics with product inhibition, and the kinetic parameters Vmax, KM e KI were correlated against the substrate initial degree of hydrolysis (total degree of hydrolysis obtained by previous action of trypsin and chymotrypsin on cheese whey proteins). Long-time batch hydrolyses, catalyzed by highly-loaded Alcalase-glyoxyl agarose-10% derivative, presented diffusion effects, with effectiveness coefficient, ηI, of ca. 0.5. / Hidrolisados protéicos de alto valor agregado podem ser obtidos através da hidrólise seqüencial de proteínas com tripsina, quimotripsina, carboxipeptidase A (CPA) e Alcalase® (preparação comercial de subtilisina). A viabilidade econômica do processo requer a utilização de enzimas imobilizadas e estabilizadas e o conhecimento da cinética das reações catalisadas com esse tipo de biocatalisador. Visando contribuir para o desenvolvimento de tal processo, os objetivos deste trabalho foram preparar derivados estáveis de CPA e Alcalase® e estudar a cinética da hidrólise de polipeptídios. Esses polipeptídios foram produzidos por hidrólise seqüencial de proteínas do soro de queijo com tripsina e quimotripsina. Utilizandose agarose entrecruzada (6% p/p para CPA e 10% p/p para Alcalase®) como suporte de imobilização, foram estudados diferentes métodos de ativação e condições de imobilização. Suportes glioxil-agarose altamente ativados (75 e 210 µeqv de grupos aldeídos por mililitro de suporte, respectivamente para CPA e Alcalase®) 25oC, pH 10,05 e tempo prolongado de contato (48 horas para CPA e 96 horas para Alcalase®) produziram os melhores derivados. Os derivados CPA-glioxil agarose-6% e Alcalase®-glioxil agarose-10% eram aproximadamente 213 e 515 vezes mais estáveis que as respectivas enzimas na forma solúvel. Esses derivados estabilizados retiveram 42% (para CPA-glioxil agarose-6%) e 54% (para Alcalase®-glioxil agarose-10%) da atividade imobilizada, medidas com substratos de menor massa molecular (hipuril-L-Phe para CPA, e Boc-Ala-ONp para Alcalase®) e substratos de maior massa molecular (polipeptídios com Phe carboxi-terminal para CPA, e caseína para Alcalase®). Esses resultados mostraram que toda a perda de atividade estava associada à distorção da molécula de enzima imobilizada, devido a multi-interação enzima-suporte. Derivados preparados em glutaraldeído-agarose-6% apresentaram impedimentos estéricos na hidrólise de substratos macromoleculares. A análise de aminoácidos de hidrolisados ácidos das enzimas solúveis e imobilizadas (para os derivados mais estáveis) mostrou que aproximadamente 30 e 40%, para CPA e Alcalase®, dos resíduos de lisina ligaram-se no suporte, sugerindo a existência de uma intensa ligação covalente multipontual entre a enzima e o suporte. As temperaturas de máximas taxas de hidrólise, usando respectivamente os derivados estabilizados de CPA e Alcalase®, foram 20oC e 10oC mais elevadas que aquelas obtidas para as respectivas enzimas solúveis. O derivado CPA-glioxil mais estável pôde ser eficientemente utilizado na hidrólise de polipeptídios (proteínas do soro de queijo hidrolisadas com tripsina e quimotripsina) a altas temperaturas (por exemplo, 60oC), liberando duas vezes mais aminoácidos aromáticos (Tyr, Phe e Trp) do que a enzima solúvel, sob as mesmas condições operacionais. O grau de hidrólise de caseína, a 80oC, obtido com o derivado Alcalase®-glioxil mais estável, foi duas vezes maior que aquele obtido com a enzima solúvel. Assim, os derivados produzidos permitem o projeto de um processo contínuo para a produção de hidrolisados protéicos, compostos de pequenos peptídios e com uma baixa concentração de aminoácidos aromáticos. Esse processo pode ser conduzido a alta temperatura, evitando-se assim problemas de contaminação microbiana do meio reacional. A hidrólise de resíduos carboxi-terminais a 45oC (pH 7,0), catalisada pelo derivado CPA-glioxil, pôde ser adequadamente representada por cinética de Michaelis-Menten, com inibição pelo substrato e produto. O modelo cinético foi representado em termos de ligações peptídicas carboxiterminais hidrolisáveis pela CPA, sem considerar-se a natureza do resíduo a ser liberado. A concentração de cada aminoácido liberado em função do tempo de hidrólise pôde ser ajustada por modelos empíricos (hiperbólico e decaimento exponencial). Assim, a partir da cinética de hidrólise total, é possível estimar-se a concentração de cada aminoácido em função do tempo de hidrólise. A hidrólise catalisada pelo derivado CPA-glioxil agarose-6%, com alta carga enzimática imobilizada, não foi limitada pela resistência difusional intrapartícula. A hidrólise de peptídios (bateladas de longa duração) a 50oC (pH 9,5), catalisada pelo derivado Alcalase®-glioxil agarose-10%, pôde ser adequadamente representada por cinética de Michaelis-Menten com inibição pelo produto, e os parâmetros cinéticos Vmax, KM e KI foram correlacionados com o grau de hidrólise inicial do substrato (grau de hidrólise total obtido pela prévia ação de tripsina e quimotripsina sobre as proteínas do soro de queijo). Hidrólises em batelada de longa duração, catalisadas por Alcalase®-glioxil agarose-10% com alta carga enzimática imobilizada, apresentaram efeitos de difusão, com um fator de efetividade, ηI, de aproximadamente 0,5.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCMAG.pdf: 44716096 bytes, checksum: e3e312b192d857e9515643f716291ed1 (MD5) Previous issue date: 2004-11-30 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work is part of a global project whose aim is the production of a cheese whey proteins hydrolysate with controlled composition. The process is composed by sequential hydrolysis of the whey proteins using trypsin, chymotrypsin and carboxipeptidase A (CPA). The phenylalanine (Phe) and the other aromatic amino acids released after action of CPA may be removed from the product, providing an adequate source of proteins for phenylketonurics patients and a final product with more pleasant flavor. After its separation, a final step of hydrolysis using the non-specific protease AlcalaseÒ produces a mixture of small peptides with better properties than a mixture of free amino acids. However, the use of enzymes in industrial processes requests its immobilization and stabilization. We have studied in this work the first two hydrolysis stages aiming to reach the following general objectives: to prepare derivatives of trypsin (on sepabeads, chitosan and agarose) and chymotrypsin (just on agarose), to study the sequential hydrolysis of the cheese whey proteins with trypsin and chymotrypsin immobilized on glyoxyl-agarose gel and to investigate the kinetic of the hydrolysis of these proteins with immobilized chymotrypsin. Trypsin-sepabeads derivatives were prepared on resins modified with iminodiacetic acid (IDA) or modified with IDA and copper. Yield of immobilization of approximately 100% and complete recovery of the enzyme on supports were obtained. Factors of stabilization in relation to the soluble enzyme from 90 times (Sepabeads- IDA-Cu2+) to 138 times (Sepabeads-IDA), at 55ºC, were reached and the trypsin- (Sepabeads-IDA) derivative showed to be more efficient in the casein hydrolysis than the trypsin-glyoxyl-agarose one. Trypsin-chitosan derivatives were prepared on coagulated matrices in NaOH solution (0.1 or 1N) and activated with glutaraldehyde (pH 7 or 10) or glycydol. Chitosan derivatives whose matrices were activated with glutaraldehyde reached 100% of yield of immobilization, while the ones activated with glycydol reached just 60%. In all the studied cases it was possible to recover completelly the enzyme on supports until the enzymatic load of 20mgEnz./gGel. Derivatives prepared on coagulated matrices in NaOH 0.1 or 1N and activated at pH 7 resulted in 100% of yield of immobilization and complete recovery of the enzyme on gel until the enzymatic load of 40mgEnz./gGel. At 40ºC, the glutaraldehyde-chitosan derivatives were approximately 460 times more stable than the soluble enzyme; at 70ºC, the glyoxyl-chitosan derivative showed to be approximately 13 times more stable than the glutaraldehyde-chitosan derivative. The trypsin-chitosan derivatives presented the highest hydrolysis activity at 50ºC and pH 9 (40ºC and pH 9 for the soluble enzyme). The best trypsin-chitosan derivative (coagulated in NaOH 0.1M and activated at pH 7) showed similar performance to the soluble enzyme in the hydrolysis of the cheese whey proteins (hydrolysis degree (DH) of 12%). Trypsin and chymotrypsin derivatives immobilized on glyoxyl-agarose gel were prepared following a protocol available in the literature (agarose activated with glycydol and oxidized with NaIO4 to obtain 75µmoles of aldehyde/mL of gel, at 25oC and pH 10.05). The factors of stabilization obtained for trypsin (3920 times) and chymotrypsin (14535 times) are according with results already published and were confirmed through acid hydrolysis of the soluble enzymes and stabilized derivatives. These experiments showed that 64.76% and 72.15% of the lysines present in the trypsin and chymotrypsin, respectively, were involved in the enzyme-support attachment. In consequence of this stabilization, the derivatives showed maximum hydrolysis activity of synthetic substrates in temperatures and pH higher than the obtained for the soluble enzymes (trypsin - 85ºC and pH 11; chymotrypsin - 70ºC and pH 10.5). Hydrolysis of the cheese whey proteins assays using trypsin were developed varing the DH from 0 to 12%. After that, the obtained mixtures were hydrolysates with chymotrypsin and carboxipeptidase A, sequentially, using long times and high enzymes concentrations. The results showed that removal of Phe of approximately 100% was obtained in the following conditions: DHtrypsin of 0%, DHchymotrypsin of 12.4% (3.05mgEnz./mL of solution - 10 hours) and 10 hours of reaction with CPA (200UHPHE/ gProtein), producing 15.5% of peptides with molecular mass (MM) lower than 1046Da. The kinetic of the hydrolysis of the whey proteins was studied and the apparent kinetic parameters of the Michaelis-Menten model taking into account competitive inhibition by the substrate ( app max V , app m K and app S K ) were calculated by initial rates method using a derivative with high enzymatic load - 40mgEnz./gGel. In this work, the substrate concentration was defined in terms of peptides bonds that could be cleaved by chymotrypsin. The effectiveness factor found for reactions developed in presence of difusional effects was 0.78. The long-term assays (10 hours) were perfectly fitted by a model where the first five minutes were described by the first order kinetic (V=kN) and times higher than five minutes were represented by a function of P/No (V=f(P/No)). / Obs.:Devido a restrições dos caracteres especias, verifcar resumo em texto completo para download.Este trabalho está inserido em um projeto global que visa a produção de um hidrolisado de proteínas do soro de queijo com composição controlada. O processo prevê ação seqüencial de tripsina, quimotripsina e carboxipeptidase A (CPA), remoção de fenilalanina (Phe) e demais aminoácidos aromáticos liberados após ação da CPA e hidrólise final com AlcalaseÒ, para obtenção de di e tripeptídeos. A mistura de pequenos peptídeos resultante possui propriedades melhores do que as de uma mistura de aminoácidos livres. A remoção da Phe e demais aminoácidos hidrofóbicos desses hidrolisados viabiliza sua utilização por pacientes portadores de fenilcetonúria, além de proporcionar sabor mais agradável ao produto final, pois estes têm sabor amargo. O uso de enzimas em processos industriais requer, contudo, a imobilização e a estabilização destas. Neste trabalho foram enfocadas as duas primeiras etapas de hidrólise visando cumprimento dos seguintes objetivos gerais: preparação de derivados de tripsina (sobre sepabeads, quitosana e agarose) e quimotripsina (apenas sobre agarose), estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro com tripsina e quimotripsina imobilizadas sobre gel glioxil- agarose e investigação da cinética da hidrólise dessas proteínas com quimotripsina imobilizada sobre agarose. Derivados tripsina-sepabeads foram preparados usando-se resina modificada apenas com ácido iminodiacético (IDA) ou modificada com IDA e posteriormente reagida com cobre. Foram obtidos rendimentos de imobilização de aproximadamente 100% e completa recuperação da enzima nos suportes utilizados, com fatores de estabilização em relação à enzima solúvel variando de 90 (derivados Sepabeads-IDACu2+) a 138 vezes (derivados Sepabeads-IDA), a 55ºC. Estudo do desempenho do derivado tripsina-(Sepabeads-IDA) no fracionamento da caseína mostrou sua maior eficiência frente ao derivado tripsina-glioxil-agarose. Derivados estabilizados tripsina-quitosana foram preparados sobre matrizes coaguladas em solução de NaOH (0,1 ou 1N) e ativadas com glutaraldeído (pH 7 ou 10) ou glicidol. Para todos os derivados tripsina-quitosana ativados com glutaraldeído obteve-se 100% de rendimento de imobilização, enquanto que o alcançado pelo derivado cuja matriz foi ativada com glicidol foi de apenas 60%. Recuperação da enzima nos géis de 100% foi obtida para todos os suportes estudados até carga de 20mgEnz./gGel. Derivados preparados sobre matrizes ativadas a pH 7, independentemente da concentração da solução coagulante (NaOH 0,1 ou 1N), resultaram em 100% de rendimento e total recuperação da enzima no gel até carga enzimática de 40mgEnz./gGel. Fatores de estabilização em torno de 460 vezes foram obtidos para derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído em relação à enzima solúvel, a 40ºC. A 70ºC, o derivado tripsina-quitosana-glioxil mostrou-se aproximadamente 13 vezes mais estável que derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído. Temperatura de 50ºC e pH 9 foram condições nas quais derivados tripsina-quitosana apresentaram maior atividade de hidrólise (para a enzima solúvel 40ºC e também pH 9). O melhor derivado tripsina-quitosana preparado (coagulação em NaOH 0,1N e ativação a pH 7) mostrou desempenho similar ao da enzima solúvel na hidrólise das proteínas do soro (grau de hidrólise (GH) de 12%). Derivados de tripsina e quimotripsina sobre gel glioxil-agarose foram preparados utilizando-se protocolo disponível na literatura (agarose ativada com glicidol e oxidada com NaIO4 para obtenção de 75mmoles de aldeído/mL de gel, a 25oC e pH 10,05). Os fatores de estabilização aqui obtidos para tripsina (3920 vezes) e quimotripsina (14535 vezes) estão em concordância com resultados já publicados. Estes altos índices de estabilização se devem à formação de ligações multipontuais entre as enzimas e o suporte, o que pôde ser confirmado pelos resultados obtidos através de hidrólises ácidas das enzimas solúveis e derivados estabilizados. Esses experimentos mostraram que 64,76% e 72,15% do total de lisinas presentes na tripsina e na quimotripsina, respectivamente, estavam envolvidas nas multiligações enzima-suporte. Em conseqüência disso, os derivados de tripsina e quimotripsina expressaram máxima atividade de hidrólise dos substratos sintéticos em temperaturas e pHs mais elevados que os observados para as enzimas solúveis (85oC e pH 11 para tripsina e 70oC e pH 10,5 para quimotripsina). Estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro foi realizado variando-se o grau de hidrólise com tripsina de 0 a 12% e submetendo-se em seguida estes hidrolisados à ação seqüencial de quimotripsina e CPA, empregando-se nessas duas últimas etapas tempo reacional prolongado e alta concentração enzimática. Os resultados obtidos mostraram que conversão em Phe próxima de 100% foi obtida quando as proteínas do soro foram diretamente hidrolisadas pela quimotripsina, atingindo-se grau de hidrólise de 12,4% com esta protease (concentração enzimática de 3,05mgEnz./mL de solução - 10 horas) e utilizando-se 200UH-PHE/gProteína nas 10 horas de reação com CPA, o que conduziu à formação de 15,5% de peptídeos com massa molecular (MM) inferior a 1046Da. O estudo das velocidades iniciais da hidrólise das proteínas do soro catalisada pela quimotripsina (derivado com alta carga enzimática 40mgEnz./gGel) forneceu os parâmetros cinéticos aparentes ap máx V , ap m K e ap S K do modelo de Michaelis-Menten com inibição pelo substrato, representado em termos de ligações peptídicas hidrolisáveis por esta enzima. O fator de efetividade determinado para reações na presença de efeitos difusionais (ensaios realizados com derivado contendo 40mgEnz./gGel) foi de 0,78 e os dados experimentais de bateladas de longa duração (10 horas) foram perfeitamente ajustados por um modelo composto onde os cinco primeiros minutos de reação foram descritos por uma cinética de primeira ordem (equação do tipo kN V = ), uma vez que neste período as proteínas ainda apresentavam elevada massa molecular e o sistema estava possivelmente sendo controlado pela difusão externa, e tempos superiores a 5 minutos por uma função de o N P , ou seja, uma equação do tipo ) N P ( f V o = . Esta última abordagem resultou em excelentes ajustes aos dados experimentais para todo o período reacional ensaiado, o que é bastante relevante dada a complexidade do sistema em questão.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2620.pdf: 1689550 bytes, checksum: 4fa47e9cd5f6de2ff9af48027193823e (MD5) Previous issue date: 2009-05-25 / Universidade Federal de Minas Gerais / The objective of this thesis was to prepare and select immobilized lipase derivatives with high catalytic activity and thermal stability to mediate the biodiesel synthesis from palm and babassu oils by ethanolic route. The experimental work was carried out in two steps. In the first, different lipases sources, including lipases from Thermomyces lanuginosus (TLL), Candida antarctica type B (CALB), porcine pancreas (PPL), Bacillus thermocatenulatus (BTL2), Pseudomonas fluorescens (LPF) and Lipex® 100L were immobilized on different supports activated by several protocols using two immobilization methods, such as physical adsorption and multipoint covalent attachment. The following matrixes were used: agarose, Toyopearl, chitosan, alginate-chitosan, octyl-agarose, hexyltoyopearl and PHB and activating agents were: glutaraldehyde, epichlorohydrin and glycidol. As expected the immobilization procedure, support and lipase source affected the catalytic properties of the immobilized derivatives and their suitability for the proposed reaction. With an exception of PPL, all lipase preparations (TLL, PFL, Lipex® 100L and CALB) showed high alkaline stability under the immobilization conditions (72 h at pH 10.05) resulting in immobilized derivatives having high hydrolytic activities. The highest hydrolytic activities were obtained by TLL immobilized on glyoxyl-agarose, glyoxyl-chitosan-alginate-TNBS, epoxy-chitosan-alginate and Lipex® 100L immobilized on epoxy-chitosan-alginate and glyoxyl-agarose. Under non-aqueous media using butyl butyrate synthesis as a model system, TLL and PFL immobilized on glyoxyl-agarose and glyoxyl-amine-toyopearl showed similar conversions. The highest thermal stability were obtained for non-aminated BTL2 immobilized on glyoxyl-agarose 10BCL (Stability Factor- SF =2648) and chemically aminated (SF=4360), followed by aminated CALB immobilized on glyoxyl-agarose BCL (SF=290) and TLL immobilized on glyoxyl-agarose BCL (SF~300). Using chitosan-alginate, the highest thermal stability was obtained for TLL immobilized on chitosan-alginate-TNBS activated with glyoxyl groups and glutaraldehyde (SF=45). The immobilization of lipases BTL2, CALB and TLL on hydrophobic supports such as octyl-agarose and hexyl-toyopearl by physical adsorption allowed obtaining thermal stable derivatives. In addition, immobilized derivatives on poly-(hydroxybutyrate) (PHB) showed high catalytic activity in both hydrolysis and esterification reactions. In the second step and based on their catalytic properties under both aqueous and non-aqueous media as well as thermal stabilities the following immobilized derivatives: TLL and PFL immobilized on glyoxyl-agarose and glyoxyl-amine-Toyopearl, TLL immobilized on chitosan-alginate-TNBS activated with glyoxyl and glutaraldehyde; TLL, PFL, Lipex® 100L and CALB immobilized by physical adsorption on PHB were selected to mediate the synthesis of biodiesel from palm and babassu oils. For derivatives prepared by multipoint covalent attachment and under the conditions used, total conversion in ethyl esters was achieved within 24 to 48 h, depending on the vegetable oil. For immobilized derivatives prepared by physical adsorption on PHB, a slight higher reaction time (72 h) was needed to attain total conversion in ethyl esters. Despite its high esterification activity, BTL2 immobilized on PHB failed to mediate the ethanolysis of both vegetable oils. The viscosity values for the biodiesel samples (3.4-4.5 cSt) are in accordance with specifications recommended by the Brazilian Petroleum Agency (ANP) to be used as biofue. / Este trabalho teve como objetivo preparar e selecionar derivados imobilizados de lipases com elevada atividade catalítica e estável termicamente para mediar a síntese de biodiesel a partir dos óleos de palma e babaçu pela rota etílica. O trabalho experimental foi desenvolvido em duas etapas. Na primeira etapa, diferentes fontes de lipases incluindo as lipases de Thermomyces lanuginosus (LTL), Candida antarctica tipo B (CALB), pâncreas de porco (LPP), Bacillus thermocatenulatus (BTL2), Pseudomonas fluorescens (LPF) e Lipex® 100L foram imobilizadas em diferentes suportes ativados por diferentes protocolos usando dois procedimentos de imobilização, adsorção física e ligação covalente multipontual. As seguintes matrizes foram testadas: agarose, Toyopearl, complexos polieletrolíticos de quitosana, octil-agarose, hexil-toyopearl e PHB e os agentes de ativação testados foram: glutaraldeído, epicloridrina e glicidol. Como esperado o procedimento de imobilização, suporte e fonte de lipase afetaram as propriedades catalíticas dos derivados imobilizados e adequação para mediar a síntese proposta. Com exceção da LPP, todas as preparações de lipase (LTL, PFL, Lipex® 100L e CALB) mostraram elevada estabilidade em meio alcalino (72 h em pH 10,05) e resultaram em derivados com elevada atividade hidrolítica. As atividades hidrolíticas mais elevadas foram obtidas pela LTL imobilizada em glioxil-agarose, glioxil-quitosana-alginato-TNBS, epóxi-quitosana-alginato e Lipex® 100L imobilizada em epóxi-quitosana-alginato e em glioxil-agarose. Na síntese de butirato de butila, as reações catalisadas por LTL e LPF imobilizadas em glioxil-agarose e glioxil-amino-toyopearl apresentaram conversões superiores a 65%. As estabilidades térmicas mais elevadas foram obtidas para BTL2 não-aminada imobilizada em glioxil-agarose 10BCL (FE=2648) e aminada quimicamente (FE=4360), seguido de CALB aminada imobilizada em glioxil-agarose 6BCL (FE=290) e LTL imobilizada em glioxil-agarose 6BCL (FE~300). Usando quitosana-alginato, as estabilidades térmicas mais elevadas foram obtidas para LTL imobilizada em quitosanaalginato- TNBS ativados com grupos glioxil e glutaraldeído (FE=45). A imobilização de lipases BTL2, CALB e LTL em suportes hidrofóbicos octil-agarose e hexil-toyopearl por adsorção física resultaram em derivados estáveis termicamente com elevada atividade catalítica em reações de hidrólise. Lipases também foram imobilizadas em poli- (hidróxibutirato) (PHB) por adsorção física e os derivados preparados apresentaram alta atividade catalítica em meio aquoso e orgânico. Tomando por base as propriedades catalíticas em meio aquoso e orgânico, bem como a estabilidade térmica foram selecionados para mediar a síntese de biodiesel os derivados de LTL e LPF imobilizados em géis glioxil-agarose e glioxil-amino-toyopearl e LTL imobilizada em quitosana-alginato-TNBS por ativação com glicidol, derivados preparados das lipases LTL, LPF, Lipex® 100L e CALB em PHB. Para as lipases imobilizadas por ligação covalente multipontual e nas condições testadas, a conversão total em ésteres de etila foi alcançada entre 24 a 48 h, dependendo do óleo vegetal. Para os derivados preparados por adsorção física em PHB, um maior tempo de reação (72 h) foi necessário para atingir a conversão total em ésteres de etila. Apesar da elevada atividade de esterificação, BTL2 imobilizada em PHB não catalisou a reação de etanólise de ambos os óleos vegetais, mas mostrou alta atividade de esterificação. Os valores de viscosidade das amostras de biodiesel purificadas (3.4-4.5 cSt) atendem as espeficacões recomendadas pela Agência Brasileira de Petróleo (ANP) para ser usado como biocombustível.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DoutLMP.pdf: 2279571 bytes, checksum: 007958befffa499c1eb6c72cc2b515c8 (MD5) Previous issue date: 2003-06-26 / Universidade Federal de Minas Gerais / The main objective of the present work was the study of PGA of B. megaterium production process and purification. The following production aspects were investigated in flasks and/or fermenter: the study of the purity of the culture, the standardization and the conservation of the inoculum, the optimization of the total time of cultivation (germination/propagation and production), the volume of the inoculum, the nutritional requirements of the B. megaterium for the production of the enzyme, the pH, the concentration of dissolved oxygen and the nutrients feeding mode. It was concluded that the conservation of the microorganism in cryovials, in presence the glycerol, showed to be efficient. The germination took 11 hours and the production, 24 hours, which is enough time for the process to reach the maximum production of the enzyme. With respect to the inoculum volume, 3 mL of inoculum/75 mL of medium (108 espores/mL of inoculum), in flasks of 500 mL, were found to be the appropriate conditions for its production. Different sources of carbon and nitrogen were studied and it was verified that glucose, glycerol and concentrations of amino acids above 10.0 g/L repress the synthesis of the enzyme. The largest production of PGA for B. megaterium occurs when the microorganism grows consuming free amino acids, phenylacetic acid (inductor), in the presence of some factor present in the cheese whey. The different components of the cheese whey were investigated and it was verified that none of the macronutrients is responsible for the significant effect of the whey on the production of the enzyme. This work allowed an increase on the enzymatic activities from 56 UI/L and 8,6 UI/g cell, obtained in the first experimental run with the standard inoculum, to 220 UI/L and 65 UI/g cell with the following conditions: 10 g/L of amino acids, 19,6 g/L of cheese whey, 0,4 g/L of salts, 2,7 g/L phenylacetic acid (AFA), initial pH 8,0, absence of pH control, addition of AFA in the beginning of the cultivation and control of dissolved oxygen around 20% of the saturation. During a research stage in Portugal, an investigation on the PGA production by Escherichia coli was also carried out in order to study the technique of adsorption in expanded bed and comparison of the conditions of production of the enzyme for E. coli with those used for B. megaterium. The maximum PGA production using E. coli was 400 UI/L. The same operational conditions used for E. coli were tested for B. megaterium and they didn't result in the enzyme production. In the study of the concentration and purification of the enzyme produced by B. megaterium, the ethanol precipitation technique was optimized. In addition, the ultrafiltration and adsorption in expanded bed (EBA) techniques were also studied. Using ultrafiltration, at 4ºC, enzyme concentrations up to 1541UI/L was reached, without thermal inactivation. The optimization of the previously study conditions results in: flow rate of 0.03 mL/s for the initial 22 mL of ethanol and 0.25 mL/s for the 98 mL of remaining ethanol, with adjustment of the pH of the broth for 6, without the previous dialysis. In the application of the adsorption in expanded bed the dynamic binding capacity found for PGA in clarified broth was about 5 UI / mL of adsorbent, with recovery of 30% of the initial enzyme. A similar value for the dynamic binding capacity was found for PGA of E. coli. / Este trabalho teve como objetivo principal estudar o processo de produção e purificação de PGA de B. megaterium. A produção foi estudada em frascos agitados e/ou fermentador, abordando-se os seguintes aspectos: estudo da pureza da cultura, padronização e conservação do inóculo, otimização do tempo total de cultivo (germinação/propagação e produção), volume do inóculo, requerimentos nutricionais do B. megaterium para a produção da enzima, pH, concentração de oxigênio dissolvido e modo de alimentação. A partir desses ensaios concluiu-se que a conservação do microrganismo em criotubos, na presença de glicerol, mostrou ser eficiente. Tempo de germinação de 11 horas e 24 horas na etapa de produção são os suficientes para atingir máxima produção da enzima. Quanto ao volume de inóculo, 3 mL de inóculo/75 mL de meio (108 esporos/mL de inóculo), em frascos de 500 mL, foram as condições ótimas encontradas para produção deste. Diferentes fontes de carbono e nitrogênio foram estudadas e verificou-se que glicose, glicerol e concentrações de aminoácidos acima de 10,0 g/L reprimem a síntese da enzima e que a maior produção de PGA por B. megaterium ocorre quando o microrganismo cresce consumindo aminoácidos livres, ácido fenil acético (indutor), na presença de algum fator presente no soro de queijo. Os diferentes componentes do soro de queijo foram investigados e verificou-se que nenhum dos macronutrientes é o responsável pelo significativo efeito do soro na produção da enzima. Este trabalho permitiu o aumento das atividades enzimáticas de 56 UI/L e 8,6 UI/g célula, obtidas no primeiro ensaio realizado com o inóculo padronizado, para 220 UI/L e 65 UI/g célula com as seguintes condições: 10 g/L de aminoácidos, 19,6 g/L de soro de queijo, 0,4 g/L de sais, 2,7 g/L de ácido fenil acético (AFA), pH inicial 8,0, ausência de controle de pH, adição de AFA no início do cultivo e controle de oxigênio dissolvido próximo de 20% da saturação. Foi também realizado, durante estágio em Portugal, estudo de produção de PGA por Escherichia coli, visando estudo posterior da técnica de adsorção em leito expandido e comparação das condições de produção da enzima por E. coli com as utilizadas para B. megaterium. A máxima produção de enzima obtida foi de 400 UI/L. As mesmas condições operacionais utilizadas para E. coli foram testadas para B. megaterium e não resultaram na produção de enzima. No estudo da concentração e purificação da enzima produzida por B. megaterium foi otimizada a técnica de precipitação com etanol, cujo estudo se iniciou em trabalho prévio, e estudadas as técnicas de ultrafiltração e adsorção em leito expandido (A.L.E). A ultrafiltração conseguiu concentrar a enzima até atividade final 1541UI/L. A temperatura mostrou ser uma variável importante, conseguindo-se evitar inativação térmica da enzima concentrada realizando-se a técnica a 4ºC. No processo de precipitação com etanol, os melhores resultados foram obtidos com vazão de 0,03 mL/s para os 22 mL iniciais de etanol e de 0,25 mL/s para os 98 mL de etanol restantes, com ajuste do pH do caldo para 6, sem a realização prévia de diálise. Na aplicação da adsorção em leito expandido a capacidade de ligação dinâmica encontrada para a PGA em caldo clarificado foi próxima de 5 UI/ mL de gel, com recuperação global de 30 % da enzima inicial. Valor similar para a capacidade de ligação dinâmica foi encontrado para PGA de E. coli.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissREM.pdf: 1870524 bytes, checksum: 11256ff68568004b18adba99fa4ba12b (MD5) Previous issue date: 2007-01-29 / Cellulases are enzymes that catalyze the hydrolysis of cellulose producing glucose. Immobilization and stabilization of these enzymes could improve enzymatic process making it more attractive by reducing costs during their use. In this work, Celluclast (Novozymes A/S, Denmark) and CG 200 (Genencor) were immobilized into chitosan and into a chitosan/alginate hybrid support, after activation of the support with glutaraldehyde and glycidol under different conditions of immobilization such as temperature and pH. Immobilization process was evaluated by calculating the immobilization yield, coupling yield and thermal stability at 65°C. Temperature and pH optimum of enzymatic activity were analyzed as well. The best derivatives were obtained with chitosan alginate activated with glycidol, after immobilization at 27°C, pH 7.0, for 16 hours. The biocatalyst presented 56.3% of immobilization yield, 40.6% of coupling yield and it 11.2 fold more stable than free enzyme at 65°C. The temperature and pH for maximum activity of the derivatives and soluble enzyme was 60°C and 50°C, pH 2.5-3.0 and 4.2, respectively. Finally, the performance of the best biocatalyst developed in this work in the hydrolysis of sugarcane bagasse was compared to one observed using soluble enzyme. Although a higher conversion has been obtained with soluble enzyme in the beginning of the reaction, the immobilized enzyme allowed to reach a higher final conversion, 70%, than the one obtained with free Celluclast, 38.9%. / Celulases catalisam hidrólise de celulose à glicose e a imobilização e estabilização da mesma podem viabilizar o processo enzimático, pois reduz custos em sua utilização. Neste trabalho, Celluclast 1.5L (Novozymes A/S, Denmark) e CG 200 (Genencor) foram imobilizadas em géis de quitosana e quitosana-alginato ativados com glutaraldeído e glicidol para posterior hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar. O processo de imobilização foi acompanhado medindo-se proteína e atividade hidrolítica da enzima em papel de filtro. Avaliaram-se rendimento de imobilização, atividade recuperada, estabilidade térmica, temperatura e pH ótimo de atividade enzimática. Os melhores derivados foram obtidos com quitosana-alginato, ativados com glicidol com temperatura de imobilização de 27°C e pH 7,0 sendo 11,2 vezes mais estáveis que a enzima livre, com rendimento em torno de 40,6% e atividade recuperada em torno de 56,3%. A temperatura ótima para os derivados foi cerca de 10 graus maior que a da enzima livre (50°C), enquanto que o pH deslocou-se de 4,2 (enzima livre) para a região entre 2,5 e 3, para os derivados. Com o melhor derivado, realizou-se a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar, que apresentou conversão de 1,8 vezes (70,0%) superior à enzima livre (38,9%).

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5706.pdf: 7869131 bytes, checksum: 3a35e736b3418ca357ef4fc2e657c0af (MD5) Previous issue date: 2013-10-16 / Universidade Federal de Minas Gerais / Enzymes are potent catalysts, but operationally fragile, expensive and soluble. Industrial applications of enzymes, often, are possible only using immobilized enzyme. Nowadays, various studies have been performed aiming to immobilize enzymes onto magnetic carriers, which allow the selective recovery of the derivative by applying an external magnetic field even in complex reaction media containing other suspended solids. There are many studies using magnetic carriers in enzymes immobilization procedures, however there are no commercially available enzymes immobilized onto magnetic materials. In these studies usually are used carriers with not ideal characteristics for applications in industrial processes. The present study aimed to develop new magnetic carriers and methods for immobilization of enzymes in these carriers, penicillin G acylase (PGA) and cellulases have been used as model enzymes. The thesis was divided into five parts, in the first part (Chapter 1) the state-of-art is presented. The second part (Chapter 2) describes the synthesis of magnetic carriers robust, cheap and with good characteristics for applications in bioprocesses. For this purpose were tested the synthesis of silica magnetic microparticles (SMMps) in water-in-oil micro-emulsion using sodium silicate as silica source and superparamagnetic iron oxide nanoparticles as magnetic core. Materials with good magnetic properties, high surface area and mesoporous structure were obtained. SMMps structure was characterized, it was possible to control the final structure of the material according to the synthesis conditions. In the third part of this study (Chapter 3) was evaluated a new concept in enzymes immobilization using magnetic materials. Magnetic tags were co-aggregated with PGA and cross-linked with glutaraldehyde, producing magnetic cross-linked enzymes aggregates (M-CLEAs). Several reaction conditions were tested producing M-CLEAs with different characteristics and strong response to external magnetic fields. Derivatives with good recovered activity and increased thermal and methanol 50% (v/v) stabilities were obtained. M-CLEAs presented superior performance, in comparison with the free enzyme, in penicillin G hydrolysis experiments, being reused for three reaction cycles without loss of activity. In the fourth part of this study (Chapter 4) the immobilization of the Trichoderma reesei cellulolytic complex onto 17 carriers using 60 different immobilization conditions was evaluated. Covalent methods to cellulases immobilization resulted in total loss of the enzymatic activity. The immobilization by adsorption allowed preserving a portion of the enzymatic activity, however, the enzyme was desorbed from the carrier with the increase in the ionic strength. The best results were achieved for adsorption in MANAE-agarose followed by cross-linking with glutaraldehyde. Hydrolysis experiments using insoluble substrates showed that it is possible to hydrolyze such substrates even using immobilized enzyme onto porous carriers. The derivative was reused for ten reaction cycles (hydrolysis of filter paper) saving more than 90% of its activity. Finally, in Chapter 5, the T. reesei cellulolytic complex was immobilized by adsorption onto SMMp activated with amino groups followed by glutaraldehyde cross-linking achieving good results in terms of recovered activity. / Enzimas são potentes catalisadores, porém frágeis operacionalmente, caras e solúveis. Aplicações industriais desses catalisadores, muitas vezes, são possíveis apenas com o uso de enzima imobilizada. Estudos indicam que o uso de suportes magnéticos para imobilizar enzimas pode permitir a recuperação seletiva do derivado através da aplicação de um campo magnético externo mesmo em meios complexos contendo outros sólidos em suspensão. Apesar de existirem muitos estudos empregando suportes magnéticos para imobilização de enzimas, não existem enzimas imobilizadas em materiais magnéticos disponíveis comercialmente. Nestes estudos geralmente são utilizados suportes magnéticos com características não ideais para aplicações em bioprocessos. O presente estudo teve como principal objetivo o desenvolvimento de novos suportes magnéticos e métodos para imobilização de enzimas nestes suportes, a enzima penicilina G acilase (PGA) e celulases foram utilizadas como modelo. O estudo foi dividido em cinco partes, no Capítulo 1 é apresentada uma introdução indicando o estado da arte. O Capítulo 2 apresenta o preparo de novos suportes magnéticos robustos, baratos e com características ótimas para aplicações em bioprocessos. Nesta etapa foi testada a síntese de micro-partículas magnéticas de sílica (SMMps) em micro-emulsão água-em-óleo, empregando silicato de sódio como fonte de sílica e nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro como núcleo magnético. Os materiais obtidos apresentaram excelentes propriedades magnéticas, alta área de superfície e estrutura mesoporosa. A partir da caracterização físico-química e morfológica das SMMps foi possível controlar a estrutura final do material de acordo com as condições de síntese. No Capítulo 3 foi avaliado um novo conceito em imobilização de enzimas empregando materiais magnéticos. Neste estudo etiquetas magnéticas foram co-agregadas com PGA e entrecruzadas com glutaraldeído, gerando agregados enzimáticos entrecruzados com propriedades magnéticas (M-CLEAs). Várias condições reacionais foram testadas rendendo M-CLEAs com diferentes características e com resposta robusta a campos magnéticos externos. Derivados imobilizados com boa atividade recuperada e incremento na estabilidade térmica e frente a metanol 50% (v/v) foram obtidos. M-CLEAs apresentaram desempenho superior ao observado para a enzima livre em experimentos de hidrólise de penicilina G, sendo reutilizados por três ciclos reacionais sem perda de atividade. No Capítulo 4 foi avaliada a imobilização do complexo celulolítico de Trichoderma reesei em 17 suportes, empregando 60 diferentes condições de imobilização. Os experimentos de imobilização realizados empregando técnicas de imobilização por união covalente ocasionaram perda total de atividade enquanto métodos de imobilização por adsorção permitiram conservar boa atividade enzimática, porém a enzima dessorveu do suporte com o aumento na força iônica do meio. Os melhores resultados foram alcançados para adsorção em MANAE-agarose seguido de entrecruzamento com glutaraldeído. Experimentos de hidrólise de substratos insolúveis mostraram que é possível hidrolisar este tipo de substrato mesmo com enzima imobilizada em suportes porosos. O derivado foi reutilizado por dez ciclos (hidrólise de papel filtro) conservando mais de 90% de sua atividade. Por fim, no Capítulo 5, o complexo celulolítico de T. reesei foi imobilizado por adsorção em SMMp ativado com grupos amino seguido de entrecruzamento com glutaraldeído apresentando bons resultados em termos de atividade recuperada.