GPCRs, particularly muscarinic receptors (mAChRs), are significant therapeutic targets in many physiological conditions. The significance of dualsteric hybrids selectively targeting mAChR subtypes is their great advantage in avoiding undesired side effects. This is attained by exploitation of the high affinity of ligand-binding to the orthosteric site and the structural diversity of the allosteric site to target an individual mAChR subtype, as well as offering signal bias to avoiding undesired transduction pathways. Furthermore, dualsteric targeting of mAChR subtypes helps in the elucidation of the physiological role of each individual mAChR subtype.
The first project was the attempt of synthesis of the M2-preferring ligand AFDX-384. AFDX-384 is known to preferentially bind to the M2 receptor subtype as an orthosteric antagonist, with partial interaction with residues in the allosteric site. This project aimed to re-trace the synthesis route of AFDX-384, to open the door to its upscaling and the future synthesis of AFDX-type dualsteric ligands. The multi-step synthesis of AFDX-384 is achieved through the synthesis of its 2 precursors, the chloro acyl derivative VIII and the piperidinyl derivative IV. Upscaled synthesis of the piperidinyl derivative IV was attained. Synthesis of the chloro acyl compound VIII was attempted. Several trials to synthesize the benzopyridodiazepine nucleus as well as its chloro-acylation resulted in the production of the novel crystal structures V and VI. X-ray crystallography was also done for crystallized molecules of the closed-ring benzopyridodiazepine VII that was previously synthesized. Chloro-acylation reactions of compound VII using phosgene seem to be attainable when done using reflux overnight. However, the use of methanol to aid in elution during silica gel column chromatography converted the expected product to the carbamate analogue IX. Hence, further attempts in purification should refrain from the use of methanol. The use of triphosgene instead of phosgene demonstrates a cleaner route for further upscaled synthesis.
The second project was the synthesis of dualsteric ligands involving variable orthosteric and allosteric moieties. Four different types of hybrids have been created over multiple steps. Dualsteric ligands have been synthesized using either a phthalimido- or 1,8-naphthalimidopropylamino moiety as the allosteric-binding group, coupled to either N-desmethyl pirenzepine or N-desmethyl clozapine using variable chain lengths. Furthermore, the synthesis of the dualsteric ligands involving N-desmethyl clozapine linked to either the super-agonist iperoxo or acetylcholine, and being connected using variable alkane chain lengths. Several reaction conditions have been investigated throughout the analysis of the optimal condition to conduct the critical final step of synthesis of these dualsteric hybrids, which involves the linking of the two segments of the hybrid together. The optimal method, which produced the least side products and highest yield, was to connect the two intermediates of the compound in absence of base, catalyst or microwaves while stirring at 35 °C for several days using acetonitrile as solvent (silica gel TLC monitoring, 0.2 M aqueous KNO3/MeOH 2:3). The ideal purification methods for the final compounds were found to be either crystallization from the reaction medium or using C18 reverse phase silica gel flash chromatography (using H2O/MeOH solvent system). All the hybrids will be subjected to pharmacological testing using the appropriate FRET assays. / G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), besonders die Familie der muscarinischen Rezeptoren, stellen wichtige therapeutische Zielstrukturen für die Behandlung einer Vielzahl an Erkrankungen dar. Die Besonderheit dualsterischer Hybridliganden, die selektiv an den muskarinischen Acetylcholinrezeptor (mAChR) binden liegt darin begründet, dass so ungewünschte Nebenwirkungen vermieden werden können. Dies wird durch die Ausnutzung der hohen Bindungsaffinität an die orthostere Stelle sowie die strukturelle Vielfältigkeit der allosteren Bindestelle erreicht, wodurch bestimmte mAChR-Subtypen adressiert und eine funktionelle Selektivität erreicht werden kann, die unerwünschte Signaltransduktionswege umgeht. Desweiteren kann die dualstere Adressierung der mAChR-Subtypen dazu beitragen, die physiologische Funktion eines jeden Rezeptors zu bestimmen und aufzuklären.
Das Ziel des ersten Teilprojektes war die Synthese des bevorzugt an M2 bindenden Liganden AFDX-384. Von diesem ist bekannt, als orthosterer Agonist bevorzugt an den M2-Rezeptorsubtyp zu binden und zum Teil Interaktionen in der allosteren Bindestelle einzugehen. Hierbei sollte die Darstellungsroute von AFDX-384 nachvollzogen werden, um eine Synthese in größerem Maßstab zu entwickeln und die Herstellung weiterer dualsterer Liganden vom AFDX-Typ zu ermöglichen. Die mehrstufige Synthese von AFDX-384 geht von zwei Vorstufen aus, dem Chloracyl VIII sowie dem Piperidinylderivat IV. Zunächst wurde das Upscaling der Synthese von IV erreicht und die Darstellung von VIII versucht. Mehrere Versuche, den Benzopyridodiazepin-Kern sowie das entsprechende chloracetylierte Derivat zu erhalten, führten zur Bildung der neuen Strukturen V und VI. Das zuvor synthetisierte, ringgeschlossene Benzopyridodiazepin VII wurde mittels Röntgenkristallstrukturanalyse charakterisiert. Die Chloracylierung von VII schien mittels Phosgens und unter Rückfluss über Nacht möglich zu sein. Allerdings wurde das Reaktionsprodukt durch den Einfluss von Methanol, das während der chromatographischen Reinigung als Fließmittel verwendet wurde, in das Carbamat-Analogon IX überführt. Daher sollten künftige Reinigungsschritte ohne die Zuhilfenahme von Methanol erfolgen. Durch den Einsatz von Triphosgen anstelle von Phosgen wird eine eindeutigere, direktere Syntheseroute zum weiteren Upscaling erreicht.
Im Rahmen des zweiten Teilprojektes wurden dualstere Liganden hergestellt, die variable orthostere und allostere Molekülteile besitzen. Durch mehrstufige Syntheseverfahren konnten vier verschiedene Typen von Hybriden hergestellt werden. Dualstere Liganden wurden dadurch erhalten, dass entweder Phthalimido- oder 1,8- Naphthalimidopropylamino-Gruppen als allostere Bindegruppe durch einen flexiblen und verschieden langen Linker mit N-Demethylpirenzepin oder N-Demethylclozapin verknüpft wurden. Außerdem wurden dualstere Liganden hergestellt, in denen N-Demethylclozapin durch einen variablen Linker entweder an den Superagonisten Iperoxo oder an Acetylcholin geknüpft ist. Der kritischste Schritt der Synthese ist die Verknüpfung der beiden Linkersegmente am Ende des Herstellungsweges. Hierfür wurden mehrere Reaktionsbedingungen untersucht, um die Kopplung optimal zu ermöglichen. Die beste Methode, bei der die wenigsten Nebenprodukte und die größten Ausbeuten erzielt wurden besteht darin, die beiden letzten Zwischenstufen in Abwesenheit einer Base, Katalysatoren oder Mikrowellenstrahlung in Acetonitril zu lösen und bei 35 °C mehrere Tage zu rühren (Reaktionskontrolle: Dünnschichtchromatographie an Kieselgel, Fließmittel: 0,2 M wässrige KNO3/MeOH 2:3). Als bestes Reinigungsverfahren stellten sich entweder die Kristallisation aus dem Reaktionsmedium oder die Verwendung einer Flash-Chromatographie-Apparatur an C18-Kieselgel dar (Eluent: H2O/MeOH). Alle synthetisierten Hybridmoleküle werden noch einer pharmakologischen Charakterisierung unter Anwendung geeigneter FRET-Testsysteme unterzogen.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:17928 |
| Date | January 2019 |
| Creators | Riad, Noura |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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