Abstract
Production of recombinant proteins and organic molecules by microbial fermentation is a widely used process in pharmaceutical, biofuel, food and chemical industries. Micro-organisms are cultivated in a bioreactor enabling a proper environment and conditions for production of the desired product molecule. Usually, however, the conditions in the bioreactor are inhomogeneous because of technical limitations such as insufficient mixing. This causes gradients in various parameters such as temperature, ph, dissolved oxygen or substrate concentration, which can have a negative effect on product quality and quantity. Understanding the effects of such environmental variations for the host organism and product molecule are crucial for the bioprocess control.
The aim of this dissertation was to study the metabolic and gene expression level response of Escherichia coli bacterium for variating conditions in the bioreactor. The responses for rapid temperature increase and oxygen limitation was studied by shift experiments. The effect of oscillating oxygen and glucose concentrations, typical for industrial scale processes, was studied with a scale-down model.
The main results were obtained in the oxygen downshift experiments. It was shown that a non-canonical amino acid norvaline, known to replace leucine in recombinant proteins, is accumulated in significant concentration under oxygen limitation. The accumulation of norvaline was also observed in the scale-down model indicating that norvaline could also be found in large scale processes. The quantitative gene expression results for the norvaline pathway genes showed no clear response. This indicates that the norvaline formation occurs due to the changes on metabolic rather than transcriptional level. The second key result of this dissertation was the finding, that the accumulation of formate, a typical anaerobic metabolite, was diminished by medium boosted with trace amounts nickel, selenium and molybdenum, enabling the activity of formate degrading enzyme complex. The results of this dissertation can be utilized in the industrial process optimisation and as a basis for further bioprocess studies. / Tiivistelmä
Vierasproteiinien ja orgaanisten molekyylien tuottaminen fermentoimalla on paljon käytetty menetelmä lääke-, bioenergia-, elintarvike- sekä kemianteollisuudessa. Mikrobit kasvatetaan bioreaktorissa, joka mahdollistaa sopivan kasvuympäristön ja tuotanto-olosuhteet halutulle tuotteelle. Usein bioreaktorin olosuhteet ovat kuitenkin epätasaiset teknisten rajoitteiden kuten riittämättömän sekoitustehon vuoksi. Tämä aiheuttaa eri muuttujien, kuten happi- ja ravinnepitoisuuden, pH:n tai lämpötilan vaihtelua ajan ja paikan suhteen, millä voi olla haitallinen vaikutus tuotteen laatuun tai saantoon. Ympäristötekijöiden muutosten isäntäsolulle tai tuotemolekyylille aiheuttamien vaikutusten ymmärtäminen ovat yksi ratkaisevista tekijöistä bioprosessien hallinnassa.
Tässä väitöskirjassa tutkittiin Escherichia coli -bakteerin aineenvaihdunnan sekä geeniekspression vasteita bioreaktorin ajan ja paikan suhteen vaihtelevissa olosuhteissa. Hapenpuutteen ja lämpötilan nousun vaikutusta tutkittiin kokeilla, joissa olosuhdetta kertaluontoisesti ja nopeasti muutettiin. Teollisille fermentointiprosesseille tyypillistä happi- ja ravinnepitoisuuksien jatkuvaa vaihtelua tutkittiin suurta bioreaktoria jäljittelevällä pienoismallilla.
Tärkeimmät tulokset liittyivät kokeisiin, joissa tutkittiin hapenpuutetta. Kokeissa kävi ilmi, että happirajoitetuissa olosuhteissa muodostuu huomattavia määriä epätavallista aminohappoa norvaliinia, jonka tiedetään korvaavan leusiinia vierasproteiineissa. Norvaliinin muodostumista havaittiin myös pienoismallilla tehdyissä kasvatuksissa, osoittaen että norvaliinia voi mahdollisesti löytyä myös suuren mitan prosesseista. Geeniekspressiomittaukset eivät osoittaneet muutoksia norvaliinin aineenvaihduntareitillä, osoittaen että havaittu norvaliinin muodostuminen tapahtuu aineenvaihdunnallisten muutosten seurauksena. Toinen tässä väitöstutkimuksessa saatu tärkeä tulos oli muurahaishapon kertymisen vähentyminen, kun kasvatusliuokseen lisättiin nikkeliä, seleeniä ja molybdeeniä aktivoimaan muurahaishappoa hajottavaa entsyymikompleksia. Tämän väitöstutkimuksen tuloksia voidaan hyödyntää teollisten prosessien optimoinnissa ja perustana uusille tutkimusaiheille.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:oulo.fi/oai:oulu.fi:isbn978-951-42-9936-0 |
| Date | 30 October 2012 |
| Creators | Soini, J. (Jaakko) |
| Contributors | Neubauer, P. (Peter), Ojamo, H. (Heikki) |
| Publisher | Oulun yliopisto |
| Source Sets | University of Oulu |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, © University of Oulu, 2012 |
| Relation | info:eu-repo/semantics/altIdentifier/pissn/0355-3213, info:eu-repo/semantics/altIdentifier/eissn/1796-2226 |
Page generated in 0.0022 seconds