Detta projekt var ett samarbete mellan Aplex Bio AB och Scilifelab. Projektets mål var att utveckla en molekylär diagnostisk panel med förmågan att detektera och diskriminera mellan 14 olika typer av patogener. Projektet innehåller 4 kapitel med fokus på olika mål. I första kapitlet utvecklades en metod för att karakterisera emissioner av fluorescerande nanopartikel kluster. Den första utvärderade metoden utnyttjade klick-kemi för att binda nanopartiklarna till makrostrukturer uppbyggda av amplifierat DNA. Den andra utvärderade metoden skapade aggregerade komplex av nanopartiklar med amplifierat DNA för att utvärdera partiklarnas emissioner. I kapitel 2 av projektet användes azid-funktionaliserade nanopartiklar levererade av Aplex Bio AB för att tvärbinda DBCO modifierade oligonukleotider. Sedan utvecklades en hybridiserings baserad metod för att kvantifiera relativa mängden oligonukleotider på partiklarna. Denna metod användes för att reproducerbart funktionalisera partiklar och utveckla nanopartikel-sonder som kan binda till DNA genom hybridisering. I kapitel 2 utvärderades även hur effektivt och specifikt de utvecklade nanopartikel-sonderna hybridiserar till DNA. I kapitel 3 utvärderades amplifiering av syntetiska ssDNA sekvenser valda från genetiska markörer av 14 patogener, DNA amplifierades med metoden RCA. Målet var att utvärdera specificiteten av amplifieringen. Specifik amplifiering av varje DNA sekvens i panelen var en förutsättning för att möjliggöra detektion och diskriminering av alla patogener i panelen. I kapitel 4 var målet att utveckla en kostnadseffektiv metod för att funktionalisera nanopartiklar med oligonukleotid sekvenser. För att göra detta användes DBCO-NHS-ester reagens och amin-modifierade oligonukleotider. Förverkligande av detta projekt skulle skapa en diagnostisk panel med potentialen att påverka det diagnostiska fältet på en global skala. När detta projekt är fullt utvecklat kan panelen modifieras för detektion av önskade DNA/RNA sekvenser vilket möjliggör ett mångfalt av applikationer, detta skulle göra panelen konkurrerande med dagens diagnostiska metoder då den kan användas i existerande mikroskopiuppsättningar. / This work was a collaboration between Aplex Bio AB and Scilifelab with the aim of developing a molecular assay capable of detecting and discriminating between 14 different pathogenic targets. There are 4 chapters with focus on different goals. In chapter one a method of evaluating emissions of fluorescent nanoparticle clusters was developed. The first approach of evaluating nanoparticle emissions was to utilize click chemistry to bind nanoparticles to macroscale structures of amplified DNA targets. The second evaluated approach was the formation of aggregated complexes of nanoparticles and amplified DNA targets. The second chapter of the thesis used azide functionalized nanoparticles supplied by Aplex Bio AB to utilize azide groups as crosslinkers and use them to functionalize the nanoparticles with DBCO oligos. A hybridization-based method was then developed to quantify relative oligo densities on the nanoparticles, enabling reproducible oligo functionalization of nanoparticles, producing nanoparticle probes that can bind to DNA. The final task of chapter 2 was evaluating the binding efficiency and specificity of the developed nanoparticle probes. The third chapter of the thesis evaluated amplification of synthetic ssDNA sequences corresponding to genetic markers of 14 pathogenic targets using RCA. The goal was to confirm specificity of chosen padlock probes and corresponding synthetic targets for each pathogen. Specific amplification of each target was a prerequisite to enable detecting and discriminating between the 14 pathogenic targets. In chapter 4 the goal was to develop a cost-effective method of oligo functionalization for nanoparticles. This chapter evaluated two main approaches of using DBCO-NHS-ester reagents to perform DBCO modification of amine-oligos. The realization of this work would develop an assay that has the potential to impact the field of diagnostics on a global scale. When fully developed, the molecular assay can be modified to detect any RNA/DNA targets which enables numerous applications, making the assay a competitive diagnostic tool which can be implemented in existing microscopy systems.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-299949 |
| Date | January 2021 |
| Creators | Narmack, Samuel |
| Publisher | KTH, Kemi |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | Swedish |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-CBH-GRU ; 2021:109 |
Page generated in 0.0024 seconds