Las propiedades del receptor nicotínico colinérgico muscular (AChR) están reguladas por los lípidos de la membrana. Por tratarse de una proteína integral, desde su síntesis hasta su aparición en la sinapsis y posterior degradación, el AChR esta inmerso en una bicapa lipídica, cuya composición está pre-determinada y finamente controlada por la célula. Por lo tanto, el análisis funcional de la relación entre los lípidos y el AChR requiere de un sistema celular que funcione a modo de tubo de ensayo, para evitar los modelos artificiales puros con membranas reconstituídas. Con este propósito, generamos modelos celulares que expresan heteróloga y onstitutivamente el AChR y en los que se puede modificar parcial y selectivamente el contenido de ciertas especies lipídicas.
En una primera etapa a través de la cotransfección del ADNc de las subunidades del AChR adulto de ratón en una línea celular con metabolismo lipídico normal, CHO-K1 (Forsayeth et al., 1990c), establecimos el sistema de referencia.
Posteriormente, generamos dos modelos experimentales con líneas celulares mutantes que eran deficientes en el metabolismo lipídico: una línea mutante de CHO-K1, denominada SPB-1deficiente en esfigomielina (SM) (Hanada et al., 1990) y otra línea derivada de CHO-K1, auxotrófica, llamada PSA-3, deficiente en fosfatidilserina (PS).
Obtuvimos la estirpe SPB-1/SPH que expresa el AChR y modula, por efecto de la temperatura, la actividad de la enzima serina palmitoil transferasa (SPT), clave en la vía de síntesis de los esfingolípidos. A temperaturas de cultivo entre 33 C y 37 C la actividad de la enzima representa sólo del 4 al 8% de la actividad normal, lo cual disminuye los niveles celulares de SM y gangliósidos como el GM3 a valores menores del 1%. Con este modelo, determinamos que no existen diferencias en los parámetros electrofisiológicos y en las propiedades farmacológicas del receptor, y caracterizamos la participación activa de la SM en los mecanismos que regulan el tráfico exocítico de la proteína a la membrana plasmática.
También generamos la línea clonal PSA/AChR, que expresa el AChR y no es capaz de realizar normalmente la síntesis de PS por tener alterada una de las enzimas que catalizan su síntesis. Por este motivo, requiere del agregado exógeno del fosfolípido para su normal crecimiento.
Transfectadas las células y seleccionados los clones positivos, analizamos el ARN por RT-PCR para determinar la expresión de las subunidades. Con los clones elegidos realizamos ensayos de unión a [125I]α-bungarotoxina, un radioligando específico para AChR, determinándose los parámetros cinéticos y farmacológicos. Los parámetros electrofisiológicos del canal se caracterizaron por la técnica de patch-clamp y el análisis topológico de la expresión por microscopía de fluorescencia. De esta manera, en cada modelo celular caracterizamos las diferencias estructurales y topológicas del AChR causadas por las variaciones en el contenido lipídico.
En el segundo capítulo de esta tesis analizamos el rol que poseen los aminoácidos que están ubicados, de cara a la membrana, en contacto directo con los lípidos. Con este propósito, modificamos la estructura primaria de la proteína por medio de mutaciones simples y dobles, en residuos cargados y muy conservados, situados en los extremos del segmento M4 a la altura de las cabezas polares de los fosfolípidos. Por co-transfección de una subunidad mutada con el resto de las subunidades en la versión salvaje, generamos cinco líneas clonales mutantes. En estos modelos se realizaron ensayos farmacológicos con [125I]-BTX, microscopía de fluorescencia y técnicas bioquímicas que nos permitieron determinar la magnitud de la expresión del receptor mutado y los cambios estructurales y funcionales que se produjeron cuando los diferentes residuos del AChR fueron mutados. / The properties of the muscle nicotinic acetylcholine receptor (AChR) are modulated by membrane lipids. As an integral protein, the AChR - from synthesis to appearance in synapses and further degradation- is immersed in a lipid bilayer. The composition of this bilayer is pre-established and finely controlled by the cell. Therefore, the functional analysis of the lipid-AChR relationship requires a cell system that behaves as test tube, to prevent pure artificial models with reconstituted membranes.
For this purpose, the AChR was heterologoulsy and constitutively expressed in cell lines, where the lipid content can be partially and selectively modified. In a first stage, the reference system was established by means of transfection of adult mouse AChR subunits cDNAs into a cell line with normal lipid metabolism, CHO-K1 (Forsayeth et al., 1990c).
Then, two experimental models were generated with mutant cell lines which were defective in lipid metabolism: a CHO-K1 mutant line, called SPB-1, deficient in sphyngomyelin (SM) (Hanada et al., 1990) and another auxotrophic line derived from CHO-K1, called PSA-3 and phosphatydilserine deficient (PS).
The SPB-1/SPH clone was obtained, which expresses the AChR and modulates, by effect of temperature, the activity of the serine palmitoyl transferase (SPT), which is key to the sphingolipids synthesis pathway. At culture temperatures between 33 C and 37 C, the enzyme activity represents only from 4% to 8% of normal activity, thus reducing cell levels of SM and gangliosides such as GM3 to values lower than 1%. With this model, we established that the electrophysiological parameters and the pharmacological properties of the receptor show no differences. However, we were able to characterize the active participation of SM in the mechanisms that regulate the exocytic protein traffic to the plasma membrane. In addition, a PSA/AChR clone line was generated, which expresses the AChR and is not capable to synthesize PS normally, because one of the enzymes that catalyzes this synthesis is altered. Thus, it requires exogenous PS for normal growth. Once the cells were transfected and the positive clones selected, we analyzed the RNA by RT-PCR to determine the expression of the subunits. With these clones, we performed binding studies with [125I]-bungarotoxin, an AChR specific radioligand, to determine kinetic and pharmacological parameters. The electrophysiological parameters of the channel were characterized by the patch-clamp technique and the topological analysis of the expression by fluorescence microscopy. In this way, on each cell line, we characterized the structural and topological AChR differences caused by lipid content variations.
In a second stage of this Thesis, the role of the aminoacids which are located at the membrane facing extremes in direct contact with the lipids was analyzed. For this purpose, we modified the primary structure of the protein by means of simple and double mutations, in highly conserved and charged residues, located at the M4 segment extremes at the level of the phospholipid polar heads. By transfection of a mutated subunit together with the rest of the subunits in their wild-type version, we generated five mutant clone lines. These models were subjected to pharmacological tests with [125I]-BTX, fluorescence microscopy and biochemical techniques that allowed us to establish the expression amount of the mutated receptor and the structural and functional changes that took place when the different residues were mutated.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/1975 |
| Date | 16 December 2009 |
| Creators | Roccamo, Ana María |
| Contributors | Barrantes, Francisco J. |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Rights | 0 |
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