Helicobacter pylori est une bactérie à Gram négatif qui colonise plus de 50% de la population humaine. Cette bactérie est l'un des pathogènes les plus présents dans la population et la colonisation se fait dans l'enfance et l'adolescence. H. pylori est responsable de l'apparition de maladies gastriques chez l'humain comme des ulcères gastriques, mais aussi des cancers gastriques. Plusieurs mécanismes contribuent aux maladies gastriques dont une infection chronique à long terme ainsi que des facteurs de virulence comme le système de sécrétion de type 4 (SST4). Le SST4 forme une seringue protéique utilisée par la bactérie pour injecter la protéine CagA dans les cellules humaines. Cette protéine a été la première protéine bactérienne classifiée comme une oncoprotéine par sa capacite à interférer et modifier de nombreuses fonctions et signaux métaboliques des cellules épithéliales gastriques. Afin d'éradiquer Helicobacter, une antibiothérapie est utilisée, cependant depuis les 10 dernières années plus de 50% des bactéries isolées de patients ont été identifiés comme étant porteuses de résistances contre aux moins un antibiotique de première ligne. L’utilisation de petites molécules organiques capables d'interférer avec les facteurs de virulence est une alternative intéressante à la thérapie aux antibiotiques. L'utilisation de ces molécules possède des avantages dont la faible pression de sélection de résistance parce qu’elles n’impactent pas des fonctions vitales des bactéries.
Le SST4 de H. pylori est composé de nombreuses protéines essentielles qui pourraient être de potentielles cibles pour des molécules inhibitrices. Nous avons choisi la cible Cagα, une ATPase homologue à VirB11 de Agrobacterium tumefaciens. Cette protéine est essentielle pour l’injection de CagA. Précédemment, notre laboratoire a identifié une petite molécule nommée 1G2 qui était capable d’interagir avec Cagα et de diminuer l’induction de l’interleukine 8 produit par les cellules gastriques lors de l’infection par des souches de H. pylori possédant un SST4 fonctionnel. A partir d’une structure cristallographique de Cagα liée à 1G2 et nous avons créé des protéines Cagα avec des mutations aux site de liaison de 1G2. En utilisant la fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) nous avons pu identifier les acides aminés qui contribuent à la liaison de 1G2 (K41, R73 et F39). Basé sur cette information nous avons utilisé la chimie médicinale pour créer une librairie de molécules dérivées de 1G2 dans le but d’identifier des inhibiteurs plus puissants. Après avoir éliminé les molécules ayant un effet toxique sur les cellules gastriques et H. pylori, nous avons sélectionné cinq molécules (1313, 1338, 2886, 2889 et 2902) qui inhibent la production d’IL-8 plus que 1G2 dans notre modèle d’infection cellulaire. Nous avons montré par DSF que les molécules interagissent toujours avec Cagα et 1338, 2889 et 2902 sont des inhibiteurs plus puissants de son activité d’ATPase. Avec le modèle d’infection, nous avons déterminé que les cinq molécules n’affectent par la présence de CagA dans le lysat de l’infection. Cependant, nous avons observé par microscopie électronique à balayage que le SST4 pilus n’était pas présent en présence des inhibiteurs. En plus, nous avons testé les effets de 1G2 sur des souches de H. pylori résistantes, à un ou plusieurs antibiotiques de première ligne, isolées de biopsie gastriques de patients. Comme dans le cas de la bactérie modèle de laboratoire, nous avons observé une diminution de l’induction des IL-8 lors de l’infection ainsi qu’une inhibition de la formation du SST4 pilus. Nous avons aussi identifié que le gène de la protéine Cagα d’une des bactéries résistantes à 1G2 (souche #3822) porte un remplacement de R73 à K ce qui pourrait expliquer la résistance à 1G2.
Pour conclure, nous avons dans cette étude caractérisé le site de liaison de 1G2 à Cagα et nous avons identifié des molécules qui sont plus puissantes comme inhibiteurs que 1G2. / Helicobacter pylori is a Gram-negative bacterium that colonizes more than 50% of the human population. This bacterium is one of the most common pathogens in the population and colonization occurs in childhood and adolescence. H. pylori is implicated in the manifestation of gastric diseases in humans such as gastric ulcers and also gastric cancer. Several mechanisms are involved in the formation of gastric diseases including long-term chronic infection as well as virulence factors such as the type 4 secretion system (T4SS). The T4SS forms a protein syringe used by the bacteria to inject the protein CagA into mammalian cells. This protein is the first bacterial protein classified as an oncoprotein by its ability to interact with numerous metabolic functions of gastric epithelial cells. To eradicate Helicobacter, antibiotic therapy is used, but for the last 10 years more than 50% of the bacteria isolated from patients have been identified as carrying resistance against at least one first-line antibiotic. The use of small molecules capable of interfering with virulence factors is being studied as an alternative to antibiotic therapy. The use of these molecules has many advantages, and they may cause lower selection pressure for resistance than antibiotics.
The H. pylori T4SS is composed of many essential proteins that could be potential targets for inhibitory molecules. We chose the target Cagα, an ATPase homologous to the model VirB11 from Agrobacterium tumefaciens. This protein is essential for the injection of CagA. Previously, our laboratory identified a small molecule coined 1G2 that interacts with Cagα and decreases the induction of interleukin-8 produced by gastric cells upon infection with H. pylori strains with functional T4SS. Based on a crystallographic study of Cagα bound to 1G2, we created Cagα proteins with mutations at the 1G2 binding site. Using differential scanning fluorimetry, we identified amino acids that contribute to 1G2 binding (K41, R73 and F39). Based on these observations, we used medicinal chemistry to create a library of molecules derived from 1G2 to create more potent inhibitors. After eliminating the molecules with a toxic effect on gastric cells and H. pylori growth, we selected five molecules with stronger effects than 1G2 on IL8 induction in our cell infection model (1313, 1338, 2886, 2889 and 2902). We observed by DSF that the molecules interact with Cagα and 1338, 2889 and 2902 are stronger inhibitors of the ATPase
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activity than 1G2. With our infection model, we determined that the five molecules do not affect the presence of CagA. However, by scanning electron microscopy we observed that the T4SS pilus was not present. In addition to the tests on a laboratory model bacterium, we evaluated 1G2 on resistant strains of H. pylori isolated from gastric biopsy from patients. Similar to the laboratory model bacterium, 1G2 decreased IL-8 induction and inhibited T4SS pilus formation. We have also identified that strain #3822 that is resistant to 1G2 carries a R73 to K mutation in the Cagα gene, which could explain the 1G2 resistance. To conclude, we have here characterized the 1G2 binding site on Cagα and we created inhibitors that are more potent than 1G2.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/32963 |
| Date | 08 1900 |
| Creators | Morin, Claire |
| Contributors | Baron, Christian |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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