A produção de células-tronco induzidas (iPSC) a partir de fibroblasto fetal canino abre caminhos para a obtenção de células pluripotentes e o estudo de sua aplicabilidade para terapias alternativas na medicina veterinária. Neste contexto, este trabalho investigou metodologias adequadas avaliando a eficiência destas, para a produção de células-tronco pluripotentes no modelo canino in vitro (CTE-like), uma vez que a produção de células-tronco embrionárias verdadeiras, cultivadas a partir da MCI de blastocistos, ainda não foi completamente caracterizada em animais domésticos. Os experimentos visaram o aumento do conhecimento de fatores envolvidos no processo de reprogramação em cães, bem como a produção de tais linhagens e sua completa caracterização. No primeiro experimento, foi comparada a infecção retroviral, já padronizada por diversos grupos, com a reprogramação epissomal, inédita para a espécie, na tentativa de induzir células à pluripotência sem a integração viral, e ainda, estratégias para o aumento da eficiência de reprogramação, onde o plasmídeo epissomal foi somado a fatores de transcrição. A reprogramação epissomal gerou colônias quando acrescida do fator c-MYC, que provavelmente, aumentou a proliferação destas células produzindo colônias iPS com morfologia típica e positivas para o teste da fosfatase alcalina. Tais resultados, ainda preliminares pra conclusões, são essenciais para o processo de obtenção de linhagens sem a integração viral, aumentando a aplicabilidade na terapia celular. No segundo experimento objetivou-se avaliar os fatores OCT4 e SOX2 associados a proteínas repórteres. Os fibroblastos que receberam estes fatores, foram analisados por citometria de fluxo, permitindo a avaliação da influência de cada fator no processo de reprogramação, além de permitir a separação (sorting) das células que integraram o gene, aumentando a eficiência de reprogramação e o conhecimento biológico dos mecanismos de integração rastreados por uma proteína repórter. A análise por microscopia de fluorescência revelou que a distribuição de proteínas repórteres foi semelhante entre as duas diferentes construções proteicas e que não se restringe a uma região da célula em particular. OCT4 e SOX2 mostraram uma elevada expressão exógena de cada gene alvo, bem como células dupla positivas. No entanto, nenhuma interação foi observada pelo menos 6 dias após a transdução. O último capítulo experimental descreveu o mecanismo de reprogramação por integração lentiviral para indução da pluripotência em fibroblastos fetais de cão. As linhagens obtidas e completamente caracterizadas neste estudo foram independentes de LIF ou qualquer outra suplementação com inibidores, resistentes ao repique enzimático (Tryple Express), sendo apenas bFGF dependentes. Foram obtidas 66 linhagens clonais, das quais 10 (7 h+mOSKM e 3hOSKM) se mantiveram por 15 ou mais passagens e foram utilizadas para todos os testes de caracterização in vitro, com eficiência máxima de reprogramação de 0,001%. Todas as colônias foram positivas para o teste da fosfatase alcalina, bem como formaram corpos embrióides e se diferenciaram de forma espontânea, além de expressarem altos níveis dos fatores endógenos OCT4 e SOX2. In vivo, as colônias foram capazes de desenvolver tumor 120 dias após a inoculação (confirmado por análise histopatológica) comprovando sua origem predominantemente mesodérmica. A integridade cromossomal das linhagens foi avaliada por hidridização FISH, que não evidenciou qualquer tipo de anomalia. A completa caracterização de tais linhagens, bem como os experimentos não integrativos e com fatores associados a proteínas repórteres, aumentam o conhecimento da tecnologia de reprogramação, estabelecendo novas estratégias para indução da pluripotência de forma mais eficaz e segura para seu uso em testes clínicos e terapia celular / The production of induced pluripotent stem cells (iPSC) from canine fetal fibroblast opens new ways for obtaining pluripotent cells and study its applicability for alternative therapies in veterinary medicine. In this context, this study investigated appropriate methods for producing pluripotent stem cells using a in vitro canine model (ESC-like), so far the production of true embryonic stem cells from ICM cultured blastocysts has not been fully characterized in domestic animals. The experiments aimed at increasing knowledge of the factors involved in reprogramming process in dogs, as well as the production of such strains and complete characterization. In the first experiment, a retroviral infection was compared to episomal reprogramming (never done for this specie) in an attempt to induce cells to pluripotency state without viral integration, also to observe the development of cells receiving separately the episomal plasmid plus transcription factors. The generation of colonies was possible only in the episomal plus c-MYC factor group, leading to increased cell proliferation producing iPS colonies with typical morphology and positive for the alkaline phosphatase detection. These results, so far as preliminary conclusions, are essential to obtaining strains without viral integration, increasing its applicability for clinical cell therapy. In the second experiment, we aimed to evaluate the OCT4 and SOX2 factors associated with fluorescent reporter proteins. These were analyzed by flow cytometry allowing the performance evaluation of each factor on the reprogramming process the fluorescence activated separation of cells containing the integrated gene, increasing the enriching the efficiency of reprogramming. Fluorescence microscopy analysis showed that the distribution of reporter protein was similar between the two different protein structures and not restricted to a particular cell region. OCT4 and SOX2 showed a high exogenous expression of each target gene, and double positive cells. However, no colony formation was observed at least 6 days after transduction. The last experimental chapter aimed to described the reprogramming mechanism of lentiviral integration to induce pluripotency in dog fetal fibroblasts. The lines obtained were fully characterized in this study, showing independency of LIF or any other supplemental inhibitors, resistance to enzymatic process (Tryple Express) and bFGF dependency only. A total of 66 clonal strains were obtained (hOSKM and h+mOSKM) while 10 (7 h+m and 3h) were maintained for 15 or more passages and used for in vitro characterization tests, with maximum efficiency of reprogramming 0.001% . All colonies were positive for the alkaline phosphatase detection, embryoid bodies formation, spontaneously differentiated and expressed high levels of endogenous OCT4 and SOX2. In vivo, the colonies were able to developed tumors 120 days after inoculation (confirmed via histopathology analysis), with predominantly mesodermal tissues. Chromosomal evaluations were made by FISH hybridization showing no chromosomal abnormality in iPSCs canine lines. The fully characterization of such lines as well as non-integrated experiments and factors associated via reporter proteins increases the knowledge of the iPSCs technology, establishing new strategies for more efficient and safe induction of pluripotency for potential use in cell therapy and clinical trials
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-30092015-114433 |
| Date | 22 July 2015 |
| Creators | Natalia Juliana Nardelli Gonçalves |
| Contributors | Carlos Eduardo Ambrosio, Fabiana Fernandes Bressan, Joaquim Mansano Garcia, Flavio Vieira Meirelles, Tathiane Maistro Malta Pereira |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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