Paracoccina (PCN) é um constituinte de Paracoccidioides brasiliensis, um patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose, micose sistêmica mais prevalente na América Latina. A PCN é uma proteína de função dual, com domínios de atividade lectínica e de N-acetilglicosaminidase. Análises proteômicas da preparação paracoccina revelaram a sua correspondência com uma proteína hipotética de P. brasiliensis do isolado 18 (Pb18), anotada como PADG-3347.1, que tem sequência polipeptídica semelhante a família das endoquitinases 18. Essas endoquitinases apresentam domínios distintos de atividade lectínica e enzimática. O conjunto de exons do gene correspondente, PADG-3347.1, foi clonado e expresso em E. coli, e as características físicas e biológicas da proteína recombinante foram comparadas com as da PCN. Além disso, a PADG-03347.1 recombinante (rPCN) foi avaliada por suas propriedades imunomoduladoras e sua capacidade em conferir proteção contra a infecção por P. brasiliensis. Nesse sentido, investigamos a interferência da administração profilática e terapêutica de rPCN no curso da infecção por P. brasiliensis em camundongos BALB/c. A histopatologia pulmonar dos camundongos tratados com a rPCN, mostrou menor ocorrência de granulomas, e estes também foram menores do que os observados nos animais controles. Consistente com a observação de poucas leveduras no centro dos granulomas, a contagem de UFC a partir do homogenato pulmonar dos camundongos tratados foi inferior ao observado nos animais controles. Além disso, a administração de rPCN, foi associada com altos níveis de IL-12, IFN-, TNF-, NO e IL-10 detectados no homogenato pulmonar. Os altos níveis de citocinas produzidos nos animais tratados com rPCN nos levou a investigar a ocorrência de interação da lectina com receptores presentes em células da imunidade inata, tais como TLR2 e TLR4. Verificamos que a rPCN ativa TLR2, nas formas homo ou heterodimérica, e TLR4, de modo independente dos correceptores CD14 e CD36. Estes dados revelam um possível mecanismo pelo qual rPCN gera proteção nos camundongos contra a PCM. rPCN, administrada terapêutica ou profilaticamente, induz a ativação de TLRs e imunidade Th1, conferindo proteção contra a infecção por P. brasiliensis. / Paracoccin is a constituent of Paracoccidioides brasiliensis, a human pathogen that causes paracoccidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Paracoccin is a dual function protein exerting lectin and N-acetylglucosaminidase activities. Proteomic analysis of paracoccin preparation revealed its correspondence with a hypothetical protein from P. brasiliensis isolate Pb18 (Pb18), annotated as PADG-3347.1, which has a polypeptide sequence similar to the family 18 endochitinases. These endochitinases have distinct lectin and enzymatic domains. The multi-exon assembly of the correspondent gene (PADG-3347) was cloned and expressed in E. coli, and the physical and biological features of the recombinant protein were compared to those of the native paracoccin. Moreover, recombinant PADG-3347.1 (rPCN) was evaluated for its immunomodulatory properties and its ability to confer protection against murine P. brasiliensis infection. Thus, we investigated the interference of prophylactic and therapeutic administration of rPCN on the course of P. brasiliensis infection in BALB/c mice. The pulmonary histopathology of the treated mice showed lower incidence of granulomas, which were also smaller than those observed in the control animals. Consistently with the observation of few yeasts in the center of the granulomas, the CFU count provided by lung homogenates of treated mice was lower than the provided by control mice. Furthermore, administration of rPCN was associated with higher levels of IL-12, IFN-, TNF-, NO and IL-10, detected in the lung homogenates of animals. The high levels of cytokines produced in the rPCN treated mice prompted us to investigate the occurrence of interaction of the lectin with receptors present in innate immune cells, such as TLR2 and TLR4. We verified that rPCN activates TLR2,in homo or heterodimeric forms, and TLR4, in a manner that does not depend on CD14 and CD36 coreceptors. These data reveal a possible mechanism by which rPCN generates protection in mice against PCM. rPCN, administered therapeutic or prophylactically, induces TLRs activation and Th1 immunity, conferring protection against P. brasiliensis infection.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-12052014-094334 |
| Date | 25 April 2014 |
| Creators | Maller, Ana Cláudia Paiva Alegre |
| Contributors | Barreira, Maria Cristina Roque Antunes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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