Atualmente a cultura da cana de açúcar tem ganhado destaque no cenário mundial devido a seu potencial uso na produção de bioenergia o qual poderia ser beneficiado desenvolvendo-se cultivares com aumento da produtividade de biomassa por unidade de área, o que é por sua vez, determinada pela arquitetura da planta. A brotação lateral é um dos principais fatores que regulam a arquitetura dos vegetais. Recentemente, esta fase do desenvolvimento tem sido estudada intensivamente em plantas consideradas modelo, elucidando em parte as vias genéticas, ambientais e hormonais que regulam este processo. Dentro desta vias, microRNAs, uma classe de pequenos RNAs não codantes que modula pós-transcricionalmente a expressão de genes endógenos, parecem ser importantes reguladores. Em cana de açúcar, a brotação lateral é importante para a arquitetura dos ramos laterais, germinação de gemas e perfilhamento. Entretanto, devido a sua complexidade genética e ausência de mutantes defectivos na brotação lateral, estudos nesta área ao nível molecular são limitados. Neste contexto, este trabalho teve por objetivos estudar em cana de açúcar a via microRNA156/fatores de transcrição do tipo SQUAMOSA promoter-binding-protein (SPL), a qual é associada à regulação do perfilhamento, bem como caracterizar molecularmente o processo de emergência de gemas axilares. Ferramentas computacionais usando o banco publico de ESTs TIGR gene índex permitiram identificar e classificar no genoma de cana de açúcar, diferentes genes associados ao processo de brotação lateral e resposta hormonal. Entres estes, seis genes SPL regulados pelo miR156 foram identificados, sendo um deles (SsSPL1) homólogo a SPLs envolvidas diretamente na regulação do perfilhamento. A expressão da SsSPL1 foi monitorada em diferentes tecidos e órgãos, juntamente com o miR156. Os dados sugerem que a SsPL1, é regulada negativamente pelo miR156, sendo esta via também conservada em cana de açúcar. Foram geradas plantas transgênicas da cultivar RB85486 com o gene endógeno SsmiR156a/b o qual codifica um precursor conservado do miR156 e parece estar associado com a evolução da arquitetura em monocotiledôneas. O acúmulo do miR156 foi avaliado em plantas transformadas via RT-qPCR encontrando variabilidade na sua expressão. Bibliotecas de pequenos RNAs foram geradas em gemas dormentes e em desenvolvimento, permitindo identificar membros de 26 famílias de miRNAs. A expressão de quatro deles, de seus genes-alvo e de outros genes selecionados foi monitorada em gemas dormentes e com 2 e 5 dias após o plantio. Interessantemente, o miR159 foi o mais expresso em gemas axilares de cana e parece ser um fator chave na emergência da gema, já que, segundo os resultados obtidos, esse miRNA parece modular a expressão do seu gene alvo SsGAMyB, o qual é um fator de transcrição implicado na ativação de genes de resposta a giberelina. Durante esta fase inicial do desenvolvimento também foi observado alterações na expressão de genes associados com processos de transdução de sinal associados aos fitohormônios auxina e etileno. Os resultados obtidos indicam que a emergência de gemas laterais é um processo dinâmico em que fitohormônios, fatores de transcrição e microRNAs participam conjuntamente para promover o crescimento e 12 desenvolvimento da nova plântula de cana de açúcar. / Sugarcane is an economically important biofuel crop that recently has become a target for improvement of sustainable biomaterial production due to its high biomass productivity and built-in containment features. Therefore, studies aiming to improve the production of biomass per area are among the most important issues in sugarcane production. Plant biomass is defined, at least in part, by its shoot architecture. Although shoot architecture (branching/tillering) is to some extend influenced by environmental factors, it is determined mainly by the plants genetic program. This includes developmental programs that are regulated by a complex network of genetic pathways that integrate endogenous and environmental cues. Several transcription factors as well as microRNAs are likely part of this network. In this study, we started to investigate the roles of the genetic pathway regulated by the microRNA156 and its targets, the transcription factors SQUAMOSA promoter-binding-protein (SPLs) in sugarcane branching/tillering. We identified six members of the SPL family that were further classified into four subfamilies. In both dicots and monocots, these SPLs are key regulators of the plant shoot architecture. We monitored the expression patterns of SsmiR156 e SsSPL1 in distinct sugarcane tissues/organs. Our observations suggest that miR156 regulates posttranscriptionally SsSPL1 mainly in leaf tissues. We generated transgenic sugarcane plants overexpressing the monocot-specific sugarcane miR156 precursor SsMIR156b/c via biolistic method. This precursor is thought to be important for the evolution of grass shoot architecture. Although we observed higher accumulation of mature SsmiR156b/c in leaf tissues of some transgenic plants as compared with tissues from non-transgenic plants, we could not detect any significant changes in their vegetative architecture. Using deep sequencing approaches, we have generated two small RNA libraries from dormant and outgrown sugarcane lateral buds. Preliminary analyses indicate that a select group of small RNAs are expressed in lateral buds, including over 200 repeat-associated small interfering RNAs (rasiRNAs) and 25 conserved microRNAs (miRNAs). Amongst the miRNAs, miR159 was the most sequenced in the two libraries. We evaluated miR159 accumulation pattern in addition to other selected miRNAs via qRT-PCR in dormant and developing buds. The majority of the evaluated miRNAs accumulate differentially during bud development, though with distinct expression patterns. Interestingly, miR159 accumulates at high levels in dormant buds, but scarcely in developing buds. Conversely, the experimentally confirmed miR159 target, a sugarcane GAMyB-like gene (SsGAMyB), is lowly expressed in dormant buds while its transcripts accumulate at higher levels in developing buds. GAMyB-like genes encode R2R3 MYB domain transcription factors that have been implicated in gibberellin (GA) and abscisic acid (ABA) signaling in germinating seeds. Our data suggest miR159 regulates GAMyB-like genes during sugarcane bud outgrowth. Similarly, SsSPL1 is regulated posttranscriptionally by the miR529, though this gene has sites for both miR529 and miR156. Auxin and ethylene-associated regulatory pathways are affected during sugarcane bud development. Taken together,our data indicate that sugarcane bud outgrowth from rhizomes is a complex developmental process involving hormones, transcription factors as well as microRNAs and other regulatory RNAs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-09022011-155403 |
| Date | 24 January 2011 |
| Creators | Fausto Andrés Ortiz-Morea |
| Contributors | Fabio Tebaldi Silveira Nogueira, Lazaro Eustaquio Pereira Peres, Silvana Aparecida Creste Dias de Souza |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Fisiologia e Bioquímica de Plantas, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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