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Previous issue date: 2007-03-28 / Universidade Federal de Sao Carlos / In animal cell cultures there are two kinds of cell death: apoptosis
(programmed cell death) and necrosis (cell death due to external sources). The inovative
method of cell death identification that have attracted interest is the use of fluorescence
microscopy and fluorescent dye (to bind DNA and RNA). Image analysis techniques has
become a useful tool in cell death quantification, once they are non destructive for the culture
and have easy application with using adjusted softwares.
Based in these new technological trends, the present work considers the
development of a methodology for quantification of apoptotic and necrotic cell death in
cultures of insect cells Drosophila melanogaster (S2). This methodology involved the
development of a experimental procedure using new dyes (YO-PRO-1 and Propidium Iodide),
that have presented advantages over the others because they are non destructive to the culture
an are able to clearly discriminate between apoptotic and necrotic cell death. The use of this
dyes was compared with the method of exclusion of Trypan blue and fluorescent dyes
Acridine Orange and Ethidium Bromide. Besides being less toxic to cells S2, YO-PRO-1 and
Propidium Iodide showed more sensitivity in the identification of death and in the calculation
of cell viability. It also envolved the development of an algorithm based on image analysis
techniques for quantification of the two kinds of cell death, less subjective than the manual
methods currently used. The algorithm showed to be efficient, fast an of easy application with
a error around 2% when compared to manual methodology. The calculated cell concentration
by the algorithm was very close to experimental. / Em cultivos de células animais existem dois tipos de morte celular: apoptose
(morte celular programada) e necrose (morte devido a lesões causadas por fontes externas). O
método inovador de identificação dessas mortes de células que tem atraído muito interesse é o
uso de microscopia de fluorescência e corantes celulares fluorescentes capazes de tingir
moléculas de DNA e RNA. Técnicas de análise de imagem têm se tornado uma ferramenta
útil nessa quantificação de morte celular, uma vez que é não destrutiva para a cultura e de
fácil aplicação com o uso de softwares adequados.
Baseado nessas novas tendências tecnológicas, o presente trabalho teve como
meta o desenvolvimento de uma metodologia para quantificação de morte apoptótica e
necrótica no cultivo de células de inseto Drosophila melanogaster (S2). Essa metodologia
envolveu o desenvolvimento de um procedimento experimental utilizando corantes novos no
mercado: o YO-PRO-1 e o Iodeto de Propídio, que têm apresentado vantagens sobre os outros
corantes por não serem destrutivos para a cultura e discriminarem claramente a morte
apoptótica da necrótica. A metodologia que faz uso destes corantes foi comparada com o
método de exclusão por Azul de Tripan e com os corantes fluorescentes Laranja de Acridina e
Brometo de Etídio. Além de serem menos tóxicos as células, o YO-PRO-1 e o Iodeto de
Propído mostraram mais sensibilidade na identificação da morte e posterior cálculo da
viabilidade celular. A metodologia também envolveu o desenvolvimento de um algoritmo
baseado em técnicas de análise de imagens para quantificação dos dois tipos de morte celular,
menos subjetiva que os métodos manuais atualmente utilizados. O algoritmo se mostrou
eficiente, rápido e de fácil aplicação, gerando um erro de 2% quando comparado com a
metodologia manual. Também realizou-se o cálculo da concentração celular por método
computacional, ficando os valores bem próximos dos experimentais.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/3981 |
| Date | 28 March 2007 |
| Creators | Silva, Bruna Gabriela |
| Contributors | Suazo, Cláudio Alberto Torres |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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