Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCKM.pdf: 1278719 bytes, checksum: e6f475e245c9c48760e1aefa654ef6c0 (MD5) Previous issue date: 2006-06-08 / Universidade Federal de Minas Gerais / ACLF is a fibrinolytic non-hemorrhagic metallopeptidase from the venom of the snake Agkistrodon contortrix laticinctus. rACLF is synthesized as a zymogen (pro- ACLF) with 412 aminoacids, while the active form of enzyme has 222 aminoacids. The ORF (open reading frame) that codes for the peptidase was isolated (from a cDNA venom gland library of A. contortrix. lacticinctus ) and characterized. This work shows the effects of rACLF on endothelial cells (HUVECs), tumor cells (HeLa, MDA-MB-231 and MCF-7) and non-tumor cell (fibroblast) as well its proteolytic activity on extracellular matrix proteins. Our results showed that rACLF inhibited the apoptosis induced by serum deprivation in HUVECs, but had no effect on cell proliferation. rACLF had direct effect on HUVECs, since it was observed an increased amount of IL-8 in the cell supernatants, in addition to the expression induction of molecules related to adhesion and inflammation processes. rACLF and rACLH were not cytotoxic to human fibroblasts. On the other hand, both proteins caused decrease of cell viability, changes in morphology, and detachment of HeLa cells. On human fibroblasts, rACLF modulated the expression of chemokines CXC, IL-8 and GRO, and chemokine CC, MCP1. The supernatant of human fibroblasts and HeLa cells were analyzed for MMP-2 (gelatinase-A) secretion. No difference was observed after 48 h incubation with rACLF and controls. rACLF presented hydrolytic activity on extracellular matrix proteins, such as laminin, fibronectin, collagen IV, and thrombospondin. Furthermore, hydrolytic activity on insulin β chain peptide was tested and compared to rACLH activity. rACLF was shown to be more efficient than rACLH on this substrate. In conclusion, the results of this study increased the knowledge on the protein effects on different cell lines and open up perspectives for new studies concerning signaling and regulation mechanisms affected by this protein activity. / A ACLF é uma metalopeptidase da peçonha da serpente Agkistrondon contortrix laticinctus. A ACLF é sintetizada na forma de zimogênio (pró-ACLF) com 412 aminoácidos, enquanto a sua forma ativa possui 222 aminoácidos. A fase aberta de leitura que codifica para a peptidase foi isolada (de uma biblioteca de cDNA feita a partir da glândula venenífera da serpente) e caracterizada. Este trabalho apresenta os efeitos da rACLF em células endoteliais (HUVECs), tumorais (HeLa, MDA-MB-231 e MCF-7) e não-tumorais (fibroblastos), bem como a atividade proteolítica da enzima sobre proteínas da matriz extracelular, como colágeno, fibronectina, laminina e trombospondina. Nossos resultados demonstraram que a rACLF inibiu a apoptose induzida por privação de soro fetal bovino em HUVECs, mas não foi capaz de induzir a proliferação celular. A rACLF apresentou efeito direto sobre as células endoteliais, aumentando a liberação de IL-8, além de induzir a expressão de moléculas envolvidas na adesão celular e reposta inflamatória. A rACLF e a rACLH não foram citotóxicas para fibroblastos humanos. Por outro lado as duas enzimas estudadas causaram redução na viabilidade alteração na morfologia e desgrudamento em células HeLa. Em fibroblastos, a rACLF modulou a expressão das quimoquinas CXC, IL-8 e GRO e CC, MCP1. Nos sobrenadantes de fibroblastos e HeLa incubados com rACLF por 48 h não foi observada diferença na secreção de MMP-2 (gelatinase-A). A rACLF apresentou atividade sobre proteínas da matriz extracelular, como laminina, fibronectina, colágeno IV e trombospondina. A rACLF também hidrolisou alguns substratos fluorogênicos e foi mais eficiente na hidrólise do substrato correspondente ao peptídeo central da cadeia β da insulina, quando comparada com a rACLH .Os resultados deste trabalho contribuíram para melhor entendimento dos efeitos da proteína estudada sobre diferentes linhagens celulares e abrem perspectivas para novos estudos voltados à elucidação dos mecanismos de regulação e sinalização afetados pela atividade da proteína.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1471.pdf: 1734309 bytes, checksum: e1a25902d99a75515b696dcd901f26a8 (MD5) Previous issue date: 2007-03-28 / Universidade Federal de Sao Carlos / In animal cell cultures there are two kinds of cell death: apoptosis (programmed cell death) and necrosis (cell death due to external sources). The inovative method of cell death identification that have attracted interest is the use of fluorescence microscopy and fluorescent dye (to bind DNA and RNA). Image analysis techniques has become a useful tool in cell death quantification, once they are non destructive for the culture and have easy application with using adjusted softwares. Based in these new technological trends, the present work considers the development of a methodology for quantification of apoptotic and necrotic cell death in cultures of insect cells Drosophila melanogaster (S2). This methodology involved the development of a experimental procedure using new dyes (YO-PRO-1 and Propidium Iodide), that have presented advantages over the others because they are non destructive to the culture an are able to clearly discriminate between apoptotic and necrotic cell death. The use of this dyes was compared with the method of exclusion of Trypan blue and fluorescent dyes Acridine Orange and Ethidium Bromide. Besides being less toxic to cells S2, YO-PRO-1 and Propidium Iodide showed more sensitivity in the identification of death and in the calculation of cell viability. It also envolved the development of an algorithm based on image analysis techniques for quantification of the two kinds of cell death, less subjective than the manual methods currently used. The algorithm showed to be efficient, fast an of easy application with a error around 2% when compared to manual methodology. The calculated cell concentration by the algorithm was very close to experimental. / Em cultivos de células animais existem dois tipos de morte celular: apoptose (morte celular programada) e necrose (morte devido a lesões causadas por fontes externas). O método inovador de identificação dessas mortes de células que tem atraído muito interesse é o uso de microscopia de fluorescência e corantes celulares fluorescentes capazes de tingir moléculas de DNA e RNA. Técnicas de análise de imagem têm se tornado uma ferramenta útil nessa quantificação de morte celular, uma vez que é não destrutiva para a cultura e de fácil aplicação com o uso de softwares adequados. Baseado nessas novas tendências tecnológicas, o presente trabalho teve como meta o desenvolvimento de uma metodologia para quantificação de morte apoptótica e necrótica no cultivo de células de inseto Drosophila melanogaster (S2). Essa metodologia envolveu o desenvolvimento de um procedimento experimental utilizando corantes novos no mercado: o YO-PRO-1 e o Iodeto de Propídio, que têm apresentado vantagens sobre os outros corantes por não serem destrutivos para a cultura e discriminarem claramente a morte apoptótica da necrótica. A metodologia que faz uso destes corantes foi comparada com o método de exclusão por Azul de Tripan e com os corantes fluorescentes Laranja de Acridina e Brometo de Etídio. Além de serem menos tóxicos as células, o YO-PRO-1 e o Iodeto de Propído mostraram mais sensibilidade na identificação da morte e posterior cálculo da viabilidade celular. A metodologia também envolveu o desenvolvimento de um algoritmo baseado em técnicas de análise de imagens para quantificação dos dois tipos de morte celular, menos subjetiva que os métodos manuais atualmente utilizados. O algoritmo se mostrou eficiente, rápido e de fácil aplicação, gerando um erro de 2% quando comparado com a metodologia manual. Também realizou-se o cálculo da concentração celular por método computacional, ficando os valores bem próximos dos experimentais.