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Previous issue date: 2015-09-09 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Considering potential molecular methods for diagnostic and/or therapeutic
purpose of infectious human diseases, such as dengue, highlights the
systematic evolution of ligands by exponential enrichment, known as SELEX. In
this method, ligands to a target are exponentially enriched generating aptamers
of DNA or RNA with high specificity, being considered as artificial antibodies. In
this work, we aimed to realize the isolation of aptamers binding to 3'-UTR
(untranslated region) of the RNA from dengue virus (DENV), because present
important conformational structures that act as functional elements into RNA
necessary in the infectious process. Total RNA of C6/36 infected cells was
extracted, submitted to reverse transcription reaction to obtain viral cDNA
(serotypes 2 and 3) and amplified by symmetric and/or asymmetric PCR
technique to produce the 3’-UTR from DENV as target, generating RNA-like by
containing deoxyuridine triphosphate (dUTP) and biotin in the 5’ region of the
target. The random library of RNA ligands was obtained by sonication of a pool
from human genomic DNA used in three successive PCR, and in the last
reaction was introduced the promoter of T7 RNA polymerase, presenting
fragments ranging from 80 to 600-bp. Eight rounds of selection were performed
between the target and the library by using paramagnetic particles coated with
streptavidin. For each round, after the incubation, the non-ligands were
removed by using magnetic platform, and the ligands were eluted with NaOH.
The eluted ligands were precipitated, submitted to RT-PCR and transcription in
vitro, completing one round of selection. For analysis of variability of ligands, the
product obtained from the eighth round was cloned and fourteen clones were
randomly selected for amplification. The results demonstrated that the aptamers
presented sizes with estimated molecular weights varying from 80 to 100-bp.
These data indicated the viability of aptamers isolation against conformational
elements present in the 3'-UTR of RNA from dengue virus, which may
contribute to future research focusing on prevention and/or control of the
disease. / Dentre os potenciais métodos moleculares para o diagnóstico e/ou terapêutica
de doenças que acometem a saúde humana, tais como a dengue, destaca-se a
seleção de ligantes pela utilização da química combinatória, conhecida como
SELEX. Nesse método, os ligantes a um alvo são enriquecidos
exponencialmente tendo como produto final a obtenção de aptâmeros de DNA
ou RNA com elevada especificidade, sendo considerados como anticorpos
artificiais. No presente trabalho foi realizado o isolamento de aptâmeros de
RNA ligantes à extremidade 3’-UTR (untranslated region) do RNA do vírus da
dengue (DENV), por apresentar elementos de RNA conformacionais e
funcionais importantes no processo infeccioso. A partir do RNA extraído de
células C6/36 infectadas foi feita a transcrição reversa (RT) para produção de
cDNA viral (sorotipos 2 e 3) e amplificação por PCR simétrica e/ou assimétrica
para a produção do alvo 3’-UTR do DENV, na forma de RNA-like por conter
desoxiuridina trifosfatada (dUTP) e biotina na extremidade 5’. A biblioteca
randômica de ligantes de RNA foi obtida por sonicação de um pool de DNA
genômico humano utilizado como alvo em três PCRs sucessivas sendo que na
última reação foi introduzido o promotor da T7 RNA polimerase e cujos
fragmentos variaram de 80 a 600-pb. Foram realizados oito rounds de seleção
entre alvo e biblioteca utilizando partículas paramagnéticas revestidas com
estreptavidina. A cada round, após o período de incubação, os
oligonucleotideos não ligantes foram removidos com o auxílio de plataforma
magnética, e os ligantes foram eluídos com NaOH. Os ligantes eluídos foram
precipitados e submetidos à RT-PCR e transcrição in vitro, finalizando um
round de seleção. Para verificar a variabilidade de ligantes, o produto do oitavo
round foi clonado e 14 clones foram selecionados aleatoriamente para
amplificação. Os resultados demonstraram que os aptâmeros isolados
possuem tamanhos distintos, com pesos moleculares estimados variando de
80 a 100-pb. Os dados aqui obtidos indicaram a viabilidade do processo de
isolamento de aptâmeros para elementos conformacionais presentes na
extremidade 3’-UTR do RNA do vírus da dengue os quais poderão contribuir
para pesquisas futuras com foco na prevenção e/ou controle da doença.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/5135 |
| Date | 09 September 2015 |
| Creators | Silva, Amanda Gabrielle da |
| Contributors | Neves, Adriana Freitas, Neves, Adriana Freitas, Yokosawa, Jonny, Souza, Eduardo Sérgio de |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Química (RC), UFG, Brasil, Regional de Catalão (RC) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | -6339953996062715594, 600, 600, 600, 600, -6789486854152681716, 1571700325303117195, -961409807440757778 |
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