During 2010 and 2011, the Loreto region of Peru experienced a dengue outbreak of unprecedented magnitude and severity for the region. This outbreak coincided with the reappearance of dengue virus-2 (DENV-2) in Loreto after almost 8 years. Whole-genome sequence indicated that DENV-2 from the outbreak belonged to lineage II of the southeast Asian/American genotype and was most closely related to viruses circulating in Brazil during 2007 and 2008, whereas DENV-2 previously circulating in Loreto grouped with lineage I (DENV-2 strains circulating in South America since 1990). One amino acid substitution (NS5 A811V) in the 2010 and 2011 isolates resulted from positive selection. However, the 2010 and 2011 DENV-2 did not replicate to higher titers in monocyte-derived dendritic cells and did not infect or disseminate in a higher proportion of Aedes aegypti than DENV-2 isolates previously circulating in Loreto. These results suggest that factors other than enhanced viral replication played a role in the severity of this outbreak.

This work was supported by Cienciativa of CONCYTEC Peru, under contract number 164-2016-FONDECYT, and the Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú), under contract number 116-PNICP-PIAP-2015. / Background: Huánuco is a central eastern region of Peru whose geography includes high forest and low jungle, as well as a mountain range that constitutes the inter-Andean valleys. It is considered a region endemic for dengue due to the many favorable conditions that facilitate transmission of the virus. Methods: A total of 268 serum samples from patients in Huánuco, Peru with an acute febrile illness were assessed for the presence of dengue virus (DENV) via RT-PCR and NS1, IgM, and IgG ELISA during December 2015 and March 2016. Results: DENV was detected in 25% of samples via RT-PCR, 19% of samples by NS1 antigen ELISA, and 10.5% of samples by IgM ELISA. DENV IgG was detected in 15.7% of samples by ELISA. The most frequent symptoms associated with fever across all groups were headache, myalgia, and arthralgia, with no significant difference between the four test methods Conclusions: In this study, DENV was identified in up to 25% of the samples using the standard laboratory method. In addition, a correlation was established between the frequency of positive results and the serological tests that determine NS1, IgM, and IgG. There is an increasing need for point-of-care tests to strengthen epidemiological surveillance in Peru. / Revisión por pares / Revisión por pares

Objective: To describe and molecularly characterize an outbreak of dengue virus (DENV) infection in Cajamarca, an Andean region in Peru. Methods: A total of 359 serum samples from patients with acute febrile illness were assessed for the presence of DENV via RT-PCR, ELISA NS1, IgM and IgG in Cajamarca, Peru from January 2017 to June 2017. The evaluation of the different diagnostic tests and their applicability was performed. Results: Dengue virus was detected in 24.7% of samples by RTPCR. Meanwhile, serological analysis detected 30.3% positive cases via ELISA NS1 antigen, 16.7% via ELISA IgG and 9.7% via ELISA IgM. Most of the cases corresponded to DENV-3 (77.5%). The use of RT-PCR performed better in primary infections (P<0.01), while detection of ELISA IgM performed better in secondary infections (P<0.01). The combination of NS1 and IgM performed better than the other assays in detecting primary (92.5%) and secondary infections (96.6%). The most frequent symptoms associated with fever were headaches, myalgias, and arthralgias across all groups. Conclusions: We report an important outbreak of dengue infection caused by DENV-3 in Cajamarca, Peru. Our findings encourage the use of NS1 antigen and IgM co-detection. These findings demonstrate an increasing expansion of DENV-3 in Peru and highlight the importance of molecular diagnosis and serotype characterization among the clinically defined dengue cases to strengthen the Peruvian epidemiological surveillance. / Ministry of Health and Welfare / Revisión por pares

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T16:29:26Z No. of bitstreams: 1 Tese_Marcia de Doutorado DEFINITIVA - Para entregar no PGBP.pdf: 21978043 bytes, checksum: 1d029677a684e2e22915d3841a8206d3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T16:29:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Marcia de Doutorado DEFINITIVA - Para entregar no PGBP.pdf: 21978043 bytes, checksum: 1d029677a684e2e22915d3841a8206d3 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O dengue tem se apresentado como um grave problema de saúde pública no Brasil, razão pela qual, vários estudos têm sido realizados com o intuito de esclarecer aspectos da epidemiologia dessa doença em diferentes localidades, com histórias distintas de circulação dos diferentes sorotipos dos vírus dengue (DENV). A implantação de um Programa de vigilância entomológica e virológica e, que desde 1986 visa detectar e monitorar a circulação dos sorotipos e genótipos DENV, resultou em distintas oportunidades, no isolamento de amostras de DENV de vetores e de casos humanos permitindo a caracterização molecular e a análise filogenética, fornecendo informações relevantes para a compreensão da interação vetor- vírus- humanos. O entendimento da variação genética no vírus quando este replica em mosquitos, e como essas variações atuam durante a transmissão entre humanos e mosquitos permanecem desconhecidos. Portanto, visando contribuir para um melhor conhecimento dos DENV e sua interação com o mosquito vetor, realizamos neste trabalho, a caracterização molecular e análise filogenética de DENV isolados de mosquitos naturalmente infectados e de casos humanos, provenientes de epidemias ocorridas entre 1986 e 2011 no Brasil. Foi demonstrado que os métodos moleculares foram fundamentais por facilitarem a rápida identificação dos vírus e consequentemente o monitoramento dos genótipos circulantes. A RT-PCR para a triagem de DENV em vetores se mostrou uma ferramenta útil para a vigilância virológica, com taxas de detecção que variaram de 0,78% a 25% no período estudado. A análise filogenética dos DENV-1 isolados de mosquitos e humanos mostrou que o genótipo V (Américas/África) continua o mesmo circulante desde a sua introdução, porém foi demonstrada a co-circulação de duas novas linhagens (II e III) no período de 2009 a 2011. O sequenciamento do genoma completo de DENV-3 isolado a partir de Ae. aegypti naturalmente infectados no Rio de Janeiro (RJ), assim como a análise da região 3´NC de vírus isolados em mosquitos e humanos, caracterizou estes vírus como pertencentes ao GIII e revelou a presença de inserções e deleções na região 3´NC do genoma. As deleções observadas na região 3´NC resultaram em estruturas secundárias porém nem todas as cepas com inserções nesta região apresentaram estrutura similar substituições exclusivas à cepa de DENV-3 isolada em mosquito foram observadas no gene NS5, incluindo a substituição que resultou na formação de um códon de terminação. O teste comercial Simplexa™ Dengue Real Time RT-PCR, disponível recentemente, foi utilizado pela primeira vez para detecção dos DENV e se mostrou um método molecular alternativo para as vigilâncias entomológica e virológica. O RT-PCR em Tempo Real possibilitou, pela primeira vez, a quantificação de DENV-1 e DENV-4 em fêmeas individuais naturalmente infectadas (1,6 x 104 cópias/mL e 1,08 x 103 cópias/mL, respectivamente). Considerando-se o elevado índice de infestação por Ae. aegypti em todo o país, o estudo da caracterização dos DENV circulantes torna-se de grande importância no conhecimento da relação vírus-vetor pela análise da variabilidade genética, dispersão e persistência de genótipos durante a transmissão destes vírus / Dengue has been a major public health problem in Brazil with several studies performed aiming to elucidate the disease epidemiology in geographically distinct areas with different dengue viruses (DENV) circulation. The establishment of an entomological and virological program since 1986 with the objective of detecting and monitoring DENV serotypes and genotypes resulted in distinct opportunities in DENV isolation from vectors and human cases, allowing the molecular characterization and phylogenetic analysis, providing relevant information for the understanding of the vector-virus-humans interactions. The understanding of the virus genetic variability when it replicates on mosquitoes and how those variations act during the transmission between humans and mosquitoes is not fully understood. Therefore, aiming to contribute for a better understanding of DENV and its interactions with the mosquito vector, we performed in this study the molecular characterization and phylogenetic analysis of viruses isolated from naturally infected mosquitoes and human cases, from epidemics occurred between 1986 and 2011 in Brazil. It has been shown that the molecular techniques were essential for allowing the rapid identification of the viruses and consequently the monitoring of the circulating genotypes. The RT-PCR for DENV screening in vectors has shown to be a useful tool for the virological surveillance, with detection rates varying from 0.78% to 25% in the studied period. The phylogenetic analysis from DENV-1 isolated from mosquitoes and human cases showed that genptype V (America/Africa) is still the same genotype circulating since this serotype introduction, however it was demonstrated the co-circulation of two distinct new viral lineages (II and III) from 2009 to 2011. The complete genome sequencing of a DENV-3 isolated from naturally infected Ae. aegypti in Rio de Janeiro (RJ) and the analysis of the 3´UTR region from viruses isolated from mosquitoes and humans, has characterized those viruses as belonging to genotype III (GIII) and revealed the presence of insertions and deletions in the 3´UTR region of the genome. The deletions observed in the 3´UTR region resulted in similar secondary structures, however not all strains with insertions were similar in structure. Exclusive substitutions to the DENV-3 isolated from the mosquitoes were observed in NS5, including a substitution leading to a stop codon formation. The Simplexa™ Dengue Real Time RT-PCR commercial kit, recently available, was used for the first time for DENV detection and it has been shown to be an alternative molecular method for the entomological and virological surveillances, The Real Time RT-PCR has allowed, for the first time the DENV-1 and DENV-4 quantification in single Ae. aegypti naturally infected (1.6 x 104 copies/mL e 1.08 x 103 copies/mL, respectively). Considering the high Ae. aegypti infestation index in the country, the characterization of DENV circulating is very relevant for the understanding of the virus-vector relations by the analysis of the genetic variability, spread and persistence of genotypes during the transmission of those viruses

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:07:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3001_1.pdf: 1265385 bytes, checksum: 195917f7eadaa711ca792e1630574a84 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Um dos determinantes envolvidos no complexo ciclo de transmissão da dengue é o nível de susceptibilidade do Aedes aegypti ao vírus dengue (DENV), ou seja, a competência vetorial, que varia entre populações de mosquitos. Identificar moléculas envolvidas na interação mosquito-vírus pode auxiliar no conhecimento dos mecanismos envolvidos na competência vetorial, até então pouco elucidados. Estudos recentes mostraram a participação de certos mecanismos na interação mosquito-DENV, porém, pouco se sabe do real papel destes na modulação da competência vetorial em mosquitos de campo ou até da relação entre eles. Mediante isso, objetivamos analisar a expressão de três moléculas representantes de diferentes mecanismos de defesa antiviral no Ae. aegypti, em resposta à infecção com vírus dengue sorotipo 2 (DENV-2), sendo elas REL1, HOP e Dicer-2, em populações de campo e de laboratório do mosquito. Para isso, as diferentes linhagens foram artificialmente infectadas com DENV-2, e tecidos variados foram coletados em diversos momentos após infecção. Tanto a quantificação viral quanto a expressão das moléculas selecionadas nas amostras foram realizadas por PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR). Os resultados mostraram que tanto o padrão de infecção viral quanto a expressão das moléculas variaram entre as populações de A. aegypti nos diferentes momentos após infecção com DENV-2. Os resultados aqui obtidos poderão ser bastante relevantes na pesquisa da interação vetor-vírus e poderão auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias de controle da dengue, como na pesquisa com mosquitos transgênicos

El texto completo de este trabajo no está disponible en el Repositorio Académico UPC por restricciones de la casa editorial donde ha sido publicado. / Objective: This study was carried out to determine the prevalence of leptospirosis among febrile patients with a suspicious clinical diagnosis of dengue fever in northern Peru. Results: A total of 276 serum samples from patients with acute febrile illness (AFI) and suspected diagnosis for dengue virus (DENV) were analyzed. We identified an etiological agent in 121 (47.5%) patients, DENV was detected in 30.4% of the cases, leptospirosis in 11.2% and co-infection by both pathogens was observed in 5.9% of the patients. In this study the most common clinical symptoms reported by the patients were: headache 89.1%, myalgias 86.9% and arthralgias 82.9%. No differences in symptomatology was observed among the different study groups. / National Research Foundation of Korea / Revisión por pares

RESUMO Alfonso Castro, H. L. Caracterização molecular de dengue tipo 3 isolados no Brasil e no Paraguai. 2010. 105f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010. O vírus da dengue (DENV), pertencente ao gênero Flavivirus da família Flaviviridae, é a arbovirose de maior impacto em saúde pública na atualidade. A infecção com qualquer do quatro sorotipos de dengue (DENV-1, -2, -3 e -4) pode ser assintomática ou causar doença febril (DF) que pode evoluir para uma forma mais grave, e algumas vezes fatais, caracterizada por derrame capilar, trombocitopenia. A introdução do DENV-3, genótipo III, nas Américas coincidiu com um aumento no número de casos graves da doença. Este vírus causou uma grande epidemia em 2002 no Rio de Janeiro e posteriormente se espalho em todas as regiões do pais, chegando inclusiva ao Paraguai. Diversos estudos filogenéticos e evolutivos foram realizados com o DENV-3 nas Américas, mas utilizando sequências genômicas parciais. Neste trabalho temos por objetivo analisar o relacionamento filogenético e evolutivo de DENV-3 isolados no Brasil e no Paraguai analisando a sequência genômica completa. A sequência de vírus isolados no Brasil (n=9) e no Paraguai (n=3) foram comparadas com 527 sequências depositadas no GenBank. As 12 cepas virais isoladas no Brasil e no Paraguai pertencem ao grupo americano do genótipo III. Analisando a árvore filogenética dos DENV-3 observamos três genótipos e diversas linhagens, sub-linhagens e clados dentro de cada genótipo. A distância genética entre os genótipos foi de 7,3 a 7,5%, entre as linhagens de 3,2 a 5,3%, entre as sub-linhagens 2,5 a 3,2% e entre os clados de 1,0 a 1,9%. A taxa evolutiva dos vírus variou entre 1,2x10-4 a 8,2x10-4 subs/sitio/ano. O ancestral comum do genótipo I teria surgido entre 1849-1945, do genótipo II entre 1916-1960, e do genótipo III entre 1876-1923. Os diferentes grupos genéticos apresentam motif de aminoácidos característicos. Estes dados serão de grande utilidade para uma melhor caracterização dos DENV-3 em futuras epidemias e, inclusive, poderão ser utilizados para seleção de candidatos a vacina. / ALFONSO CASTRO, H. L. Molecular characterization of dengue type 3 isolated in Brazilian and Paraguay. 2010. 105f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010. Infections of humans with dengue viruses (DENV), which belong to the genus Flavivirus(family, Flaviviridae), can be subclinical or cause illnesses ranging from a mild, flu-like syndrome with rash (dengue fever [DF]) to a severe and some times fatal disease, characterized by capillary leakage, thrombocytopenia, and sometimes hypovolemic shock (hemorrhagic dengue fever [DHF/DSS]). DENV are classified in four immunological distinct serotypes: DENV-1 to 4. Recently, a dramatically increase of DHF/DSS cases in the Americas have bee see, and this increase coincided with the introduction of the dengue virus type 3, genotype III. This virus causes a great epidemic in 2002 in the city of Rio de Janeiro and later, the virus spread in Paraguay. Phylogenetics and evolutionary studies have bee carried out with DENV-3 isolated worldwide, but using sequences partial genomic. In this work, we have analyzed the genetic diversity of DENV-3 of Brazilian and Paraguayan isolated, analyzing the complete sequences genomic. The Brazilian (n=9) and Paraguayan (n=3) isolated, were compared with 527 sequences deposited in the GeneBank. Theses isolated, belong to the American group of the genotype III. The phylogenetic analysis of complete genome of the DENV-3, confirmed the existence of three known genotypes and suggested the presence of other groups within each genotype named of the lineages, sub-lineages and clades. The genetic distance among the genotypes were of 7,3 to 7,5%, among the lineages of 3,2 to 5,3%, among the sub-lineages of 2,5 to 3,2% and among clades of 1,0 to 1,9%. The evolutionary rates of the viruses varied among 1,2x10-4 to 8,2x10-4 s/s/y. The age of the ancestral common more recent of the genotype I, possibly are among 1849-1945, the ancestral common of the genotype II, among 1916-1960 and the ancestral common more recent of the genotype III, among 1876-1923. The different genetic groups present motif of amino acids. These data could provide information for a better understanding of the evolution of theses viruses, and even for selection of candidate vaccine

RESUMO Alfonso Castro, H. L. Caracterização molecular de dengue tipo 3 isolados no Brasil e no Paraguai. 2010. 105f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010. O vírus da dengue (DENV), pertencente ao gênero Flavivirus da família Flaviviridae, é a arbovirose de maior impacto em saúde pública na atualidade. A infecção com qualquer do quatro sorotipos de dengue (DENV-1, -2, -3 e -4) pode ser assintomática ou causar doença febril (DF) que pode evoluir para uma forma mais grave, e algumas vezes fatais, caracterizada por derrame capilar, trombocitopenia. A introdução do DENV-3, genótipo III, nas Américas coincidiu com um aumento no número de casos graves da doença. Este vírus causou uma grande epidemia em 2002 no Rio de Janeiro e posteriormente se espalho em todas as regiões do pais, chegando inclusiva ao Paraguai. Diversos estudos filogenéticos e evolutivos foram realizados com o DENV-3 nas Américas, mas utilizando sequências genômicas parciais. Neste trabalho temos por objetivo analisar o relacionamento filogenético e evolutivo de DENV-3 isolados no Brasil e no Paraguai analisando a sequência genômica completa. A sequência de vírus isolados no Brasil (n=9) e no Paraguai (n=3) foram comparadas com 527 sequências depositadas no GenBank. As 12 cepas virais isoladas no Brasil e no Paraguai pertencem ao grupo americano do genótipo III. Analisando a árvore filogenética dos DENV-3 observamos três genótipos e diversas linhagens, sub-linhagens e clados dentro de cada genótipo. A distância genética entre os genótipos foi de 7,3 a 7,5%, entre as linhagens de 3,2 a 5,3%, entre as sub-linhagens 2,5 a 3,2% e entre os clados de 1,0 a 1,9%. A taxa evolutiva dos vírus variou entre 1,2x10-4 a 8,2x10-4 subs/sitio/ano. O ancestral comum do genótipo I teria surgido entre 1849-1945, do genótipo II entre 1916-1960, e do genótipo III entre 1876-1923. Os diferentes grupos genéticos apresentam motif de aminoácidos característicos. Estes dados serão de grande utilidade para uma melhor caracterização dos DENV-3 em futuras epidemias e, inclusive, poderão ser utilizados para seleção de candidatos a vacina. / ALFONSO CASTRO, H. L. Molecular characterization of dengue type 3 isolated in Brazilian and Paraguay. 2010. 105f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010. Infections of humans with dengue viruses (DENV), which belong to the genus Flavivirus(family, Flaviviridae), can be subclinical or cause illnesses ranging from a mild, flu-like syndrome with rash (dengue fever [DF]) to a severe and some times fatal disease, characterized by capillary leakage, thrombocytopenia, and sometimes hypovolemic shock (hemorrhagic dengue fever [DHF/DSS]). DENV are classified in four immunological distinct serotypes: DENV-1 to 4. Recently, a dramatically increase of DHF/DSS cases in the Americas have bee see, and this increase coincided with the introduction of the dengue virus type 3, genotype III. This virus causes a great epidemic in 2002 in the city of Rio de Janeiro and later, the virus spread in Paraguay. Phylogenetics and evolutionary studies have bee carried out with DENV-3 isolated worldwide, but using sequences partial genomic. In this work, we have analyzed the genetic diversity of DENV-3 of Brazilian and Paraguayan isolated, analyzing the complete sequences genomic. The Brazilian (n=9) and Paraguayan (n=3) isolated, were compared with 527 sequences deposited in the GeneBank. Theses isolated, belong to the American group of the genotype III. The phylogenetic analysis of complete genome of the DENV-3, confirmed the existence of three known genotypes and suggested the presence of other groups within each genotype named of the lineages, sub-lineages and clades. The genetic distance among the genotypes were of 7,3 to 7,5%, among the lineages of 3,2 to 5,3%, among the sub-lineages of 2,5 to 3,2% and among clades of 1,0 to 1,9%. The evolutionary rates of the viruses varied among 1,2x10-4 to 8,2x10-4 s/s/y. The age of the ancestral common more recent of the genotype I, possibly are among 1849-1945, the ancestral common of the genotype II, among 1916-1960 and the ancestral common more recent of the genotype III, among 1876-1923. The different genetic groups present motif of amino acids. These data could provide information for a better understanding of the evolution of theses viruses, and even for selection of candidate vaccine

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:49:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DeniseMCS_DISSERT.pdf: 1722274 bytes, checksum: 95bd3c1c6be5db7e268ae35a47572f0b (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Dengue is considered as the most important arthropod-borne viral disease throughout the world due to the high number of people at risk to be infected, mainly in tropical and subtropical regions of the planet. The etiologic agent is Dengue Virus (DENV), it is a single positive-stranded RNA virus of the family Flavivirus, genus Flaviviridae. Four serotypes are known, DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4. One of the most important characteristic of these viruses is the genetic variability, which demands phylogenetic and evolutionary studies to understand key aspects like: epidemiology, virulence, migration patterns and antigenic characteristics. The objective of this study is the genetic characterization of dengue viruses circulating in the state of Rio Grande does Norte from January 2010 to December 2012. The complete E gene (1485 pb) of DENV1, 2 e 4 from Brazilian (Rio Grande do Norte) patients was sequenced. Phylogenetic analysis was performed using MEGA 5.2 software, Tamura-Nei model and Neighbor-Joining trees were inferred for the datasets. In Brazil, there is just one DENV-1 genotype (genotype V), one DENV-2 genotype (Asian/American) and two DENV-4 genotypes (genotypes I and II). Brazilian strains of DENV-1 are subdivided in two different lineages (BR-I and BR-II), the Brazilian strains of DENV-2 are subdivided in four lineages (BRI-IV) and genotype II of DENV-4 is subdivided in three Brazilian lineages (BRI-III). The viruses isolated in RN belong to lineage BR-II (DENV-1), BR-IV (DENV-2) and BR-III (DENV-4).The Caribbean and near Latin American countries are the main source of these viruses to Brazil. Amino acids substitutions were detected in three domains of E protein, this makes clear the necessity of studies that associate epidemiological and molecular data to better understand the effects of these mutations. This is the first study about genetic characterization and evolution of Dengue viruses in Rio Grande do Norte, Brazil / A dengue ? considerada a doen?a transmitida por artr?podes mais importante do mundo devido ao elevado n?mero de pessoas que correm o risco de contra?-la, principalmente em regi?es tropicais e sub-tropicais do planeta. O agente etiol?gico da doen?a ? o v?rus dengue (DENV), um v?rus de RNA fita simples e polaridade positiva, pertencente ? fam?lia Flavivridae e ao g?nero Flavivirus. S?o conhecidos quatro sorotipos distintos: DENV-1, DENV-2, DENV-3 E DENV-4. Uma das suas principais caracter?sticas ? a elevada variabilidade gen?tica que torna clara a necessidade da realiza??o de estudos filogen?ticos e evolutivos com o objetivo de compreender aspectos essenciais como: epidemiologia, virul?ncia, padr?es de migra??o e caracter?sticas antig?nicas. O objetivo deste estudo foi realizar a caracteriza??o gen?tica dos v?rus dengue circulantes no estado do Rio Grande do Norte durante o per?odo de Janeiro de 2010 a Dezembro de 2012. Realizou-se o sequenciamento do gene do envelope (1485pb) dos sorotipos DENV-1 (N=6), DENV-2 (N=6) e DENV-4 (N=4) isolados de casos cl?nicos de diferentes munic?pios do estado do Rio Grande do Norte. A an?lise filogen?tica foi realizada utilizando o programa Mega v5.2, m?todo de Neighbor-Joining e modelo Tamura-Nei. No Brasil, foi constada a circula??o de apenas um gen?tipo de DENV-1 (gen?tipo V), um gen?tipo DENV-2 (asi?tico/americano) e dois gen?tipos de DENV-4 (gen?tipos I e II) no Brasil. As cepas brasileiras de DENV-1 est?o dividas em duas linhagens temporalmente distintas (BR-I e BR-II), as cepas brasileiras de DENV-2 est?o subdividas em quatro linhagens (BRI-IV) e o gen?tipo II de DENV-4 apresentou tr?s linhagens de cepas brasileiras (LI-III). Os v?rus isolados no Rio Grande do Norte pertencem a linhagem BR-II (DENV-1), BR-IV (DENV-2) e BR-III (DENV-4). A fonte de importa??o destes v?rus para o Brasil ? principalmente o Caribe e pa?ses pr?ximos da Am?rica Latina. Foram detectadas substitui??es de amino?cidos ao longo dos tr?s dom?nios da prote?na E, tornando clara a necessidade da realiza??o de estudos que associem dados epidemiol?gicos e moleculares para melhor compreens?o dos efeitos dessas muta??es. Este ? o primeiro estudo sobre caracteriza??o gen?tica e evolu??o dos v?rus dengue no Estado do Rio Grande do Norte, Brasil

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-01-20T15:41:36Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Gabrielle da Silva - 2015.pdf: 1218291 bytes, checksum: 56dd4b22c77bb02a83c9d20a4cc4e0ce (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-01-21T07:54:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Gabrielle da Silva - 2015.pdf: 1218291 bytes, checksum: 56dd4b22c77bb02a83c9d20a4cc4e0ce (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-21T07:54:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Gabrielle da Silva - 2015.pdf: 1218291 bytes, checksum: 56dd4b22c77bb02a83c9d20a4cc4e0ce (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-09-09 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Considering potential molecular methods for diagnostic and/or therapeutic purpose of infectious human diseases, such as dengue, highlights the systematic evolution of ligands by exponential enrichment, known as SELEX. In this method, ligands to a target are exponentially enriched generating aptamers of DNA or RNA with high specificity, being considered as artificial antibodies. In this work, we aimed to realize the isolation of aptamers binding to 3'-UTR (untranslated region) of the RNA from dengue virus (DENV), because present important conformational structures that act as functional elements into RNA necessary in the infectious process. Total RNA of C6/36 infected cells was extracted, submitted to reverse transcription reaction to obtain viral cDNA (serotypes 2 and 3) and amplified by symmetric and/or asymmetric PCR technique to produce the 3’-UTR from DENV as target, generating RNA-like by containing deoxyuridine triphosphate (dUTP) and biotin in the 5’ region of the target. The random library of RNA ligands was obtained by sonication of a pool from human genomic DNA used in three successive PCR, and in the last reaction was introduced the promoter of T7 RNA polymerase, presenting fragments ranging from 80 to 600-bp. Eight rounds of selection were performed between the target and the library by using paramagnetic particles coated with streptavidin. For each round, after the incubation, the non-ligands were removed by using magnetic platform, and the ligands were eluted with NaOH. The eluted ligands were precipitated, submitted to RT-PCR and transcription in vitro, completing one round of selection. For analysis of variability of ligands, the product obtained from the eighth round was cloned and fourteen clones were randomly selected for amplification. The results demonstrated that the aptamers presented sizes with estimated molecular weights varying from 80 to 100-bp. These data indicated the viability of aptamers isolation against conformational elements present in the 3'-UTR of RNA from dengue virus, which may contribute to future research focusing on prevention and/or control of the disease. / Dentre os potenciais métodos moleculares para o diagnóstico e/ou terapêutica de doenças que acometem a saúde humana, tais como a dengue, destaca-se a seleção de ligantes pela utilização da química combinatória, conhecida como SELEX. Nesse método, os ligantes a um alvo são enriquecidos exponencialmente tendo como produto final a obtenção de aptâmeros de DNA ou RNA com elevada especificidade, sendo considerados como anticorpos artificiais. No presente trabalho foi realizado o isolamento de aptâmeros de RNA ligantes à extremidade 3’-UTR (untranslated region) do RNA do vírus da dengue (DENV), por apresentar elementos de RNA conformacionais e funcionais importantes no processo infeccioso. A partir do RNA extraído de células C6/36 infectadas foi feita a transcrição reversa (RT) para produção de cDNA viral (sorotipos 2 e 3) e amplificação por PCR simétrica e/ou assimétrica para a produção do alvo 3’-UTR do DENV, na forma de RNA-like por conter desoxiuridina trifosfatada (dUTP) e biotina na extremidade 5’. A biblioteca randômica de ligantes de RNA foi obtida por sonicação de um pool de DNA genômico humano utilizado como alvo em três PCRs sucessivas sendo que na última reação foi introduzido o promotor da T7 RNA polimerase e cujos fragmentos variaram de 80 a 600-pb. Foram realizados oito rounds de seleção entre alvo e biblioteca utilizando partículas paramagnéticas revestidas com estreptavidina. A cada round, após o período de incubação, os oligonucleotideos não ligantes foram removidos com o auxílio de plataforma magnética, e os ligantes foram eluídos com NaOH. Os ligantes eluídos foram precipitados e submetidos à RT-PCR e transcrição in vitro, finalizando um round de seleção. Para verificar a variabilidade de ligantes, o produto do oitavo round foi clonado e 14 clones foram selecionados aleatoriamente para amplificação. Os resultados demonstraram que os aptâmeros isolados possuem tamanhos distintos, com pesos moleculares estimados variando de 80 a 100-pb. Os dados aqui obtidos indicaram a viabilidade do processo de isolamento de aptâmeros para elementos conformacionais presentes na extremidade 3’-UTR do RNA do vírus da dengue os quais poderão contribuir para pesquisas futuras com foco na prevenção e/ou controle da doença.