Einleitung: Ischämische Schlaganfälle ziehen ausgeprägte Entzündungsprozesse im Gehirn sowie Immunreaktionen in der Körperperipherie nach sich, welche den Erkrankungsverlauf und die Regeneration maßgeblich beeinflussen. Die Modulation dieser Immunantwort stellt folglich einen vielversprechenden experimentellen Ansatz in der Schlaganfalltherapie dar. Der ischämische Schlaganfall ist außerdem mit verschiedenen Komorbiditäten und Risikofaktoren assoziiert, deren Auswirkungen auf die komplexen postischämischen pathophysiologischen Prozesse nur in Teilen aufgeklärt sind. So hat eine arterielle Hypertonie (Bluthochdruck) als wichtigster modifizierbarer Risikofaktor durch die Induktion von Gefäßschäden eine zentrale Bedeutung für die Pathogenese von ischämischen Schlaganfällen und geht außerdem mit einer Aktivierung des Immunsystems einher. Der konkrete Einfluss der Hypertonie auf die postischämische Entzündungsreaktion wurde bislang nicht hinreichend untersucht. Die Einbeziehung wichtiger Begleiterkrankungen, wie Bluthochdruck, in die präklinische Schlaganfallforschung gewinnt zunehmend an Bedeutung, da ein erweitertes Verständnis der pathophysiologischen Zusammenhänge auch eine bessere Übertragbarkeit neuer immunmodulatorischer Therapiekonzepte auf den Menschen in Aussicht stellt.
Zielstellung: Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Identifizierung pathofunktioneller Zusammenhänge zwischen der Immunantwort nach Schlaganfall und manifestem Bluthochdruck. Dafür wurde die zentrale und periphere Entzündungsreaktion nach experimentellem Schlaganfall in einem prämorbiden hypertensiven Tiermodell (spontan-hypertensive Ratte, SHR) im Vergleich mit normotensiven Tieren mithilfe von vorwiegend durchflusszytometrischen, histologischen und molekularbiologischen Methoden analysiert. Daneben sollte das verwendete hypertensive Tiermodell für die Untersuchung immunologischer Aspekte der translationalen Schlaganfallforschung evaluiert werden.
Tiere, Material und Methoden: Für alle Tierversuche und Organentnahmen wurden ausschließlich männliche Ratten der Stämme Wistar-Kyoto und SHR im Alter von 12 bis 14 Wochen verwendet. Die Induktion des ischämischen Infarkts erfolgte mithilfe eines permanenten, transkraniellen Schlaganfallmodells oder mittels photochemischer Thrombose. In Abhängigkeit von der Untersuchungsgruppe wurden die Tiere 1 oder 4 Tage nach Infarktinduktion bzw. Sham-Operation schmerzfrei getötet. Neben wenigen neuroanatomischen und neurofunktionellen Ausleseparametern wurde als Hauptzielgröße die Immunzellverteilung im Gehirn und im Blut erfasst. Dafür wurden Hirnzellisolate und Vollblutproben mit maximal 8 fluoreszenzgekoppelten Antikörpern in verschiedenen Kombinationen markiert und in einem 3-Laser-Durchflusszytometer (FACSCanto II) gemessen und ausgewertet. Zudem wurden in kryokonservierten Hirnschnitten relevante Immunzellpopulationen und Adhäsionsmoleküle mittels Immunfluorezenztechniken markiert und für die Darstellung der räumlichen Verteilung mit einem Konfokal-Mikroskop (LSM710, Zeiss) analysiert. Zusätzlich wurde die Gen-und Proteinexpression selektiver Zytokine und Adhäsionsmoleküle in dissoziiertem Hirngewebe ermittelt. Die statistische Auswertung wurde je nach erfasster Zielgröße mittels zweiseitigem t-Test, Wilcoxon Rangsummentest, Pearson-Korrelation oder Varianzanalyse-Verfahren durchgeführt. Ein Signifikanzniveau von p<0,05 wurde für alle statistischen Verfahren festgelegt.
Ergebnisse: Neben einer vergrößerten Läsion konnte in hypertensiven Tieren insbesondere eine gesteigerte Infiltration von Zellen des angeborenen Immunsystems in das ischämische Hirn gezeigt werden. Eine Verschiebung des Makrophagen-Granulozyten-Verhältnisses wies darüber hinaus auf eine veränderte Entzündungskinetik bei Vorliegen von Bluthochdruck hin. Weiterhin wurde in Tieren mit arterieller Hypertonie eine erhöhte Zahl von zirkulierenden Monozyten und Granulozyten beobachtet. Im Hirngewebe von spontan-hypertensiven Ratten nach Schlaganfall wurden außerdem eine verminderte Expression des antiinflammatorisch wirksamen Zytokins Interleukin 10, erhöhte Expressionsraten selektiver Leukozyten-rekrutierender Chemokine sowie eine vermehrte Expression des Adhäsionsmoleküls ICAM-1 auf infiltrierenden Leukozyten erfasst. Daneben konnten modellabhängige Einflüsse der verschiedenen Induktionsmethoden auf die Immunreaktion identifiziert werden.
Schlussfolgerung: Die Ergebnisse weisen deutlich auf einen Zusammenhang zwischen einem bestehenden arteriellen Hypertonus und einer gesteigerten entzündlichen Reaktion im Gehirn nach experimentellem Schlaganfall hin und zeigen mögliche zugrundeliegende Mechanismen auf. Gleichzeitig unterstreicht die Arbeit durch eine differenzierte Analyse methodischer und modellabhängiger Einflüsse die Unerlässlichkeit, präklinische Ergebnisse kritisch zu hinterfragen und in unterschiedlichen Modellen zu überprüfen. Auf Grundlage der Untersuchungen kann die spontan-hypertensive Ratte zudem als ein für die translationale Schlaganfallforschung geeignetes prämorbides Tiermodell beurteilt werden, in welchem sich der Einfluss des Risikofaktors Bluthochdruck auf die Entwicklung und den Verlauf der postischämischen Entzündung gut abbilden lässt.:Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
2 Literaturübersicht
2.1 Humaner Schlaganfall - Grundlagen
2.1.1 Epidemiologie und sozioökonomische Bedeutung
2.1.2 Allgemeine Definition und Ätiologie
2.2 Postischämische Entzündung und systemische Immunantwort
2.2.1 Allgemein
2.2.2 Initialer Pathomechanismus der sterilen Entzündung im Gehirn
2.2.3 Immunzellen in der postischämischen Entzündung
2.2.4 Periphere Immunmodulation und postischämische Immunsuppression
2.2.5 Auflösung der Entzündungsreaktion
2.3 Schlaganfall und Hypertonie
2.4 Translation - Schlaganfall im Tiermodell
2.4.1 Tiermodelle
2.4.2 Methoden zur Induktion des experimentellen Schlaganfalls
2.4.3 Translationsproblematik
2.4.4 Die spontan-hypertensive Ratte als prämorbides Tiermodell
2.5 Therapieverfahren und therapeutische Ansätze
3 Zielstellung und Aufbau der Arbeit
4 Publikation 1
5 Publikation 2
6 Zusammenfassende Diskussion
6.1 Infarktvolumina und funktionelle Daten
6.2 Immunzytologie im Hirngewebe
6.3 Immunzytologie im peripheren Blut
6.4 Leukozytenrekrutierung ins ischämische Gewebe
6.5 Fazit, Limitationen und Ausblick
7 Zusammenfassung
8 Summary
9 Literaturverzeichnis
Danksagung / Introduction: Ischemic strokes lead to a sequence of immune responses, including pronounced tissue inflammation in the brain as well as distinct reactions of the peripheral immune system that consistently influence disease process and outcome. The modulation of these immune responses therefore represents a promising experimental approach in stroke therapy. Ischemic stroke is also associated with various comorbidities and risk factors whose effects on the complex postischemic pathology have only been partially elucidated. Being the most important modifiable risk factor this especially applies to arterial hypertension that has a central role in the pathogenesis of ischemic stroke by inducing vascular damage but is also associated with a strong activation of the immune system. However, the specific influence of hypertension on postischemic inflammation has not been sufficiently investigated. Besides, the integration of hypertension and other important concomitant diseases is becoming a more regular tool in preclinical stroke modelling in order to expand the understanding of pathophysiological interactions and overcome the translational gap of new immunomodulatory therapies.
Aim: The main objective of this work is the identification of pathofunctional interations between the immune response after stroke and preexisting arterial hypertension. For this purpose, the central and peripheral inflammatory response after experimental stroke was investigated in a premorbid hypertensive animal model (spontaneously hypertensive rat, SHR) in comparison with normotensive animals by means of flow cytometric, histological and molecular biological methods. In addition, the hypertensive animal model was supposed to be assessed regarding its suitability for the investigation of immunological aspects in translational stroke research.
Material and Methods: For all animal experiments and organ removal, only male rats of the Wistar Kyoto and SHR strains aged 12 to 14 weeks were used. Induction of experimental stroke was performed using either a permanent transcranial stroke model or photochemical thrombosis model. Depending on the study group, animals were killed painlessly 1 or 4 days after infarct induction or sham surgery respectively. In addition to few neuroanatomic and neurofunctional readout parameters, immune cell distribution in the brain and blood was captured as primary variable. Therefore, brain cell isolates and whole blood samples labeled with a maximum of 8 fluorescence-coupled antibodies in different combinations were measured and analyzed in a 3-laser flow cytometer (FACSCanto II). Furthermore, immunofluorescence techniques were applied on cryopreserved brain sections in order to image spatial distribution of relevant immune cell populations and adhesion molecules by means of confocal microscopy (LSM710, Zeiss). In addition, the mRNA and protein expression of selective cytokines and adhesion molecules was determined in dissociated brain tissue. Depending on the targeted parameter statistical analyses were performed by using two-sample t-test, Wilcoxon rank-sum test, Pearson correlation coefficient or analysis of variance. A significance level of p<0.05 was set for all statistical methods.
Results: In addition to an enlarged lesion, in hypertensive animals an increased infiltration of cells of the innate immune system to the ischemic brain area was detected. A shift of the macrophage-granulocyte-ratio further indicated an altered inflammatory profile in hypertensive rats. Furthermore, an increased number of circulating monocytes and granulocytes were observed in animals with hypertension. In brain tissue of SHR after stroke, a decreased expression of the anti-inflammatory cytokine interleukin 10 were recorded along with increased expression levels of selective leukocyte-recruiting chemokines and an increased expression of the adhesion molecule ICAM-1 on infiltrating leukocytes. In addition, caused by different induction methods, model-dependent impact on the immune reaction could be identified.
Conclusion: The results clearly indicate a relationship between existing arterial hypertension and an increased inflammatory response in the brain after experimental stroke and point out potential underlying mechanisms. At the same time, by adopting a differentiated view of methodological and model-dependent influences, the work underscores the need for critical reflection and constant verification of preclinical results in different models. Finally the work validates the SHR strain as a suitable premorbid preclinical system for further translational research since it well models the influence of hypertension on the development and course of postischemic inflammation.:Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
2 Literaturübersicht
2.1 Humaner Schlaganfall - Grundlagen
2.1.1 Epidemiologie und sozioökonomische Bedeutung
2.1.2 Allgemeine Definition und Ätiologie
2.2 Postischämische Entzündung und systemische Immunantwort
2.2.1 Allgemein
2.2.2 Initialer Pathomechanismus der sterilen Entzündung im Gehirn
2.2.3 Immunzellen in der postischämischen Entzündung
2.2.4 Periphere Immunmodulation und postischämische Immunsuppression
2.2.5 Auflösung der Entzündungsreaktion
2.3 Schlaganfall und Hypertonie
2.4 Translation - Schlaganfall im Tiermodell
2.4.1 Tiermodelle
2.4.2 Methoden zur Induktion des experimentellen Schlaganfalls
2.4.3 Translationsproblematik
2.4.4 Die spontan-hypertensive Ratte als prämorbides Tiermodell
2.5 Therapieverfahren und therapeutische Ansätze
3 Zielstellung und Aufbau der Arbeit
4 Publikation 1
5 Publikation 2
6 Zusammenfassende Diskussion
6.1 Infarktvolumina und funktionelle Daten
6.2 Immunzytologie im Hirngewebe
6.3 Immunzytologie im peripheren Blut
6.4 Leukozytenrekrutierung ins ischämische Gewebe
6.5 Fazit, Limitationen und Ausblick
7 Zusammenfassung
8 Summary
9 Literaturverzeichnis
Danksagung
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:76971 |
| Date | 14 December 2021 |
| Creators | Möller, Karoline |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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