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Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O diagnóstico da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) é feito pela detecção de marcadores sorológicos e moleculares, porém o custo destas metodologias é bastante elevado e a coleta de sangue para a realização destes ensaios além de requerer pessoal treinado, é difícil em áreas remotas ou com poucos recursos. O objetivo deste estudo foi otimizar protocolos e padronizar métodos de diagnóstico molecular para infecção pelo HCV em amostras de sangue coletado em papel de filtro (SPF) para facilitar o acesso ao diagnóstico em áreas remotas ou com recursos limitados. Para isto, 99 indivíduos forneceram amostras pareadas de soro e SPF, dentre os quais 59 eram anti-HCV reagente e 40 eram não reagentes em suas amostras de soro. As amostras anti-HCV reagentes foram submetidas à técnica de quantificação comercial. Para o desenvolvimento da RT-PCR quantitativa (RT-qPCR) in house, uma curva padrão interna foi construída utilizando um plasmídeo contendo o inserto do HCV e iniciadores e sonda foram desenhados para a região 5´NC do HCV. Para otimização da técnica, a concentração de cDNA, transcriptase reversa e números de ciclos de reação foram avaliados. Para a extração de RNA de HCV em amostras de SPF, sete métodos foram avaliados. A sensibilidade, especificidade, correlação, reprodutibilidade e presença de inibidores da RT-PCR quantitativa também foram determinados. O conjunto de QIAamp DNA Mini Kit foi o método mais eficiente para extração do RNA do HCV em SPF. A RT-qPCR in house desenvolvida foi capaz de quantificar o HCV no soro de 44 amostras onde a mediana de carga viral foi inferior aquela observada na técnica comercial (log10 4,94 e log10 6 cópias de HCV/mL, respectivamente). A faixa de detecção do método in house foi de 10 a 109 cópias de HCV por reação
Para a detecção de HCV em SPF foi necessário o aumento da transcriptase reversa e de cDNA, permitindo que 35 amostras fossem detectadas com um limite mínimo de detecção igual a 58,5 cópias/mL e a mediana de carga viral foi semelhante à observada nas respectivas amostras de soro avaliadas pela técnica comercial (log10 5,38 e log10 5,89 cópias de HCV/mL, respectivamente). Obteve-se boa reprodutibilidade da RT-qPCR in house através da análise da curva padrão e de amostras de soro e SPF. Não foi observada a presença de inibidores de reação utilizando o GAPDH como controle interno. Quando comparado com a metodologia comercial, a RT-qPCR apresentou sensibilidade de 74,58% (IC95% 61,5-85,0) em soro e 59,3% (IC95% 45,7-71,9) em SPF, e a especificidade foi igual a 100% para ambos espécimes. Quando a RT-qPCR foi avaliada entre os dois espécimes clínicos, a sensibilidade da técnica em SPF foi igual a 65,9% (IC95% 50,0-79,5) e a especificidade foi igual a 100%. Quarenta e cinco amostras de soro e quinze amostras de SPF foram amplificadas na RT-PCR qualitativa, onde 43 amostras de soro e 11 amostras de SPF foram sequenciadas. Entre as amostras de soro, 29 foram classificadas como subgenótipo 1b, 13 como subgenótipo 1a, 1 como genótipo 3. Entre as amostras de SPF, 9 foram classificadas como subgenótipo 1b e 2 como subgenótipo 1a. Foi observada alta homologia nucleotídica entre as sequencias de HCV das amostras pareadas de soro e SPF onde todas foram classificadas como genótipo 1. Conclui-se que o sangue em papel de filtro pode ser utilizado para detecção, quantificação e análise filogenética do HCV, sendo uma ferramenta promissora para estudos de epidemiologia da hepatite C / The
d
iagnosis of hepatitis C virus (HCV) infection is made by detection of molecular and serologic
al
markers, but the cost of these methodologies is quite high and blood sample
collection
requires
trained personnel
what
it is difficult in remote areas or
prese
nting
few resources. The aim of this study
was to
optimize
protocols and standardize molecular diagnostic methods for HCV infection in
dried
blood samples (DBS) to facilitate access to diagnosis in remote areas or with limited resources. For
this, 99 indiv
iduals provided paired serum and DBS
samples
,
where
59
of them
were anti
-
HCV
rea
ctive
and 40 were non
-
reactive in their serum samples.
A
nti
-
HCV positive samples were subjected
to commercial quantification technique. For the development of quantitative RT
-
P
CR (RT
-
qPCR) in
house, an internal standard curve was constructed using a plasmid containing the insert and HCV
primers and probe designed for the 5'
non coding (
NC
)
region of HCV. For optimization
of these
technique
s
, the concentration of cDNA, reverse tr
anscriptase and numbers of cycles of reaction were
evaluated. For the extraction of HCV RNA in DBS samples, seven methods were evaluated. The
sensitivity, specificity, correlation, reproducibility and presence of inhibitors in quantitative RT
-
PCR
were also
determined.
Q
IAamp DNA Mini Kit was the most efficient method for
HCV RNA
extraction
among
DBS
samples
. The
in house
RT
-
qPCR was able to quantify HCV
among 44
serum samples
where the median viral load was lower than that observed in commercial technique (
4.94
log
10
and
6
log
10
copies of HCV / mL, respectively). The range of
HCV
detection
using
in house
RT
-
qPCR
was 10
-
10
9
copies of HCV per reaction. For
HCV
detection in DBS
, it
was necessary to increase reverse
transcriptase and cDNA
concentration giving
35
HCV RNA reactive
samples with a limit of detection
equal to 58.5 copies
of HCV
/ m
L
and the median viral load was similar to that observed in their sera
evaluated by commercial technique (5.38 log
10
and 5.89 log
10
copies of HCV / mL, respectively).
In
hous
e
RT
-
qPCR
presented
good reproducibility
using
standard curve and
paired DBS and sera
samples
. It was not observed
the presence of inhibitors of the reaction using GAPDH as internal
control.
In house
RT
-
qPCR showed a sensitivity of 74.58% (95% CI 61.5 to 8
5.0) in serum and 59.3%
(95% CI 45.7 to 71.9) in DBS, and the specificity was 100% for both specimens
compared to the
commercial methodology
. When the RT
-
qPCR was evaluated in two clinical specimens, the sensitivity
of the technique in DBS was equal to 65.
9% (95% CI 50.0 to 79.5) and specificity was 100%. Forty
-
five serum samples
and 15
DBS
samples
were amplified in qualitative RT
-
PCR, where 43 serum
samples and
11
DBS
samples were sequenced. Among the serum samples, 29 were classified as
HCV
subgenotype 1b
,
1
3
as subgenotype 1a, genotype 1 and 3. Among
DBS
samples,
9
were
9
classified as
HCV
subgenotype 1b and
2
as
HCV
subgenotype 1a.
HCV nucleotide sequences
presented
high homology between paired
DBS and sera
samples
and
all
of them
were classified as
geno
type 1.
It is
conclude that dried blood spot may be used for detection, quantification and
phylogenetic analysis of HCV and
it
is a promising tool for studying the epidemiology of hepatitis C
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13502 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Marques, Brunna Lemos Crespo |
| Contributors | Filippis, Ana Maria Bispo de, Favacho, Alexsandra Rodrigues de Mendonça, Ferreira, Davis, Santos, Flavia Barreto dos, Almeida, Adilson José de, Villar, Lívia Melo |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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