La derivació de línies de cèl∙lules mare embrionàries (ESCs) depèn de factors relacionats tant amb
l’embrió com amb el procés de derivació, el coneixement dels quals és de gran importància per tal
d’incrementar l’eficiència d’establiment d’aquestes línies. Les ESCs de ratolí (mESCs), en concret,
representen un model d’especial rellevància en ciència bàsica per tal d’optimitzar uns protocols de
derivació. La present tesi doctoral pretén aclarir alguns dels paràmetres que podrien ser importants
durant el procés de derivació de mESCs a partir de blastòmers aïllats dels estadis embrionaris de 4 i 8
cèl∙lules.
En la primera part del treball, s’ha analitzat la influència del mètode de derivació, el nombre de
blastòmers aïllats i l’estadi embrionari, en l’eficiència d’establiment de línies de mESCs. Els resultats
obtinguts indicaren que l’eficiència d’establiment és més elevada quan es produeix en un medi de cultiu
definit sense sèrum evitant, així, la diferenciació espontània. Pel que respecta a la influència del nombre
de blastòmers aïllats, tant en estadi de 4 com 8 cèl∙lules, el rendiment del procés incrementa utilitzant
un major nombre de blastòmers aïllats, de manera que la màxima eficiència es produeix quan s'utilitza
la meitat de l'embrió com a màxim per no comprometre la viabilitat del mateix. Finalment, els estadis
embrionaris que van aportar una major eficiència de derivació de línies van ser els estadis posteriors a la
compactació (mòrula i blastocist). No es van trobar diferències entre els estadis de 4 i 8 cèl∙lules.
Recentment, s’ha determinat la importància de les unions adherents amb E‐cadherina en la derivació i el
manteniment de línies de mESCs i també humanes (hESCs). En una segona part del treball es va estudiar
la importància d’aquest tipus d’unió tant en la proliferació com en l’inici del procés de derivació a partir
de blastòmers únics aïllats en estadi de 8 cèl∙lules (grup 1/8). Amb aquest objectiu es va unir una
proteïna quimèrica formada pel domini extracel∙lular de l'E‐cadherina i el domini Fc de la IgG1 humana
(E‐cad‐Fc) a la superfície dels blastòmers del grup de 1/8. Aquesta proteïna quimèrica es creu que
desencadena una cascada de senyalització semblant a la que es produiria quan dos o més blastòmers
contacten a través d’unions amb E‐cadherina nativa, el que es tradueix en un increment en la taxa de
divisió dels blastòmers individuals i en l’eficiència de derivació de mESCs després d’una exposició de 24
h.
Finalment, donat que existeixen evidències moleculars i citològiques que indiquen que els blastòmers
podrien tenir la seva localització en la ICM o el trofectoderma (TE) del blastocist prefixada ja en estadis
embrionaris primerencs, l’aïllament d’un blastòmer concret de l’embrió amb un destí preferencial a
formar part de la ICM podria incrementar l’eficiència del procés de derivació. En la part final del treball,
es va intentar determinar si l’aïllament de blastòmers concrets en estadi de 4 cèl∙lules produeix
eficiències de derivació diferents en funció de l’ordre i l’orientació dels plans de divisió en estadi de 2
cèl∙lules. A partir d’experiments de seguiment dels blastòmers al llarg del desenvolupament amb un
colorant lipofílic vam determinar que els blastòmers procedents de la primera divisió en sentit
equatorial tendien a formar part del TE del blastocist. No es va trobar una tendència clara per als
blastòmers procedents de la primera divisió en estadi de 2 cèl∙lules en sentit meridional. Els experiments
de derivació de línies de mESCs, en canvi, mostraren eficiències de derivació semblants per tots els grups estudiats. Se sap que l’aïllament de blastòmers pot incrementar el seu potencial de
desenvolupament, de manera que tots ells tindrien les mateixes possibilitats de formar una línia de
mESCs. / The derivation of embryonic stem cell lines (ESCs) depends on factors related to both the embryo and
the derivation process, which knowledge is of great importance to increase the establishment efficiency
of these lines. Mouse ESCs (mESCs), in particular, represent a model of special relevance in basic science
to optimize the derivation protocols. This thesis aims to clarify some of the parameters that could be
important during mESCs derivation from isolated blastomeres at 4‐ and 8‐cell stages.
In the first part of this work, we tested the influence of the derivation method, the number of isolated
blastomeres and the embryonic stage on the derivation efficiency of mESCs. Results indicated that the
establishment efficiency is higher when a defined medium is used without adding fetal calf serum, thus
avoiding spontaneous differentiation. Regarding the influence of the number of isolated blastomeres,
both at 4‐ and 8‐cell stages, the efficiency of the process increases using a higher number of isolated
blastomeres, so that maximum efficiency is observed when using the half the embryo as a maximum to
not compromise the viability of it. Finally, the embryonic stages that offer greater efficiency of mESCs
lines were post‐compacted stages (morula and blastocyst). No differences were found between 4‐ and
8‐cell stages.
Recently, it has been determined the importance of E‐cadherin adherents junctions in the derivation
and maintenance of mESCs lines and also in human (hESC). In the second part of this work, we studied
the importance of this type of junction in both proliferation and in the beginning of the derivation
process from single and isolated blastomeres at the 8‐cell stage (group 1/8). To this end, we adhered a
chimeric protein consisting of the extracellular domain of E‐cadherin and the Fc domain of human IgG1
(E‐cad‐Fc) on the surface of 1/8 blastomeres. This chimeric protein is thought to simulate the signaling
produced when two or more blastomeres contact through native E‐cadherin junctions. This resulted in
an increased division rate of individual blastomeres and in the derivation efficiency of mESCs after an
exposure of 24 h.
Finally, given that there are molecular and cytological evidence suggesting that early blastomeres may
have a predefined fate in their future allocation in the ICM or trophectoderm (TE) of the blastocyst, the
isolation of a particular blastomere which has a predetermination to be allocated in the ICM could
increase the derivation efficiency. At the end of the work, we tried to determine if the isolation of
individual blastomeres at the 4‐cell stage cells produced an increased derivation efficiency based on the
order and orientation of the division plans at the 2‐cell stage. From lineage tracing experiments with a
lipophilic dye, we observed that blastomeres from the first division in an equatorial orientation tend to
contribute to the TE with more cells. We did not find a clear tendency from blastomeres originated from
a meridional division. Experiments about mESC derivation showed similar efficiencies from all the groups studied. It is known that the isolation of blastomeres may increase their developmental
potential, so they all would have the same chance to derive an ESC line.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/48644 |
| Date | 04 May 2011 |
| Creators | González Garrido, Sheyla |
| Contributors | Santaló, Josep, Ibáñez, Elena, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Biologia Cel·lular i de Fisiologia |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | Unknown |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 182 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0058 seconds