O melhoramento genético das plantas cítricas, pelos métodos tradicionais, é dificultado por uma série de características da biologia de reprodução da espécie. Assim a utilização de técnicas modernas de biotecnologia, como a cultura de tecidos, a manipulação genética e a biologia molecular, têm se mostrado atrativas para o melhoramento genético da cultura. O objetivo deste trabalho é avaliar a transformação genética em variedades de laranja doce (Citrus sinensis) usando o gene xylA como gene de seleção. O trabalho foi realizado com a estirpe EHA 101 de Agrobacterium tumefaciens, contendo o plasmídeo pNOV1457, com o gene xylA. Os isolados da bactéria foram mantidos em meio de cultura YEP suplementado com os antibióticos (ácido nalidíxico, canamicina e estreptomicina). Segmentos de epicótilo foram incubados, por um período de 20 minutos, com a suspensão bacteriana. Após a inoculação, os segmentos foram secos em papel toalha estéril, e incubados em placa de petri (100 x 15 mm) contendo o meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1), em ausência de luz, à temperatura de 24 C, por um período de 3 dias, com acetoseringona e sem acetoseringona durante o cocultivo. Após o co-cultivo, os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção e regeneração, constituído do meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xilose (15 mg.L-1). A transformação genética foi confirmada pela detecção do gene xylA nas plantas regeneradas por PCR. A extração do DNA foi feita pelo método de Dellaporta et al. (1983) e as reações de PCR foram conduzidas em termociclador PTC-100 (MJ Research) utilizandose "primers" específicos para detecção do gene xylA. Analisando os dados obtidos verificou-se que foram obtidas plantas transgênicas, utilizando-se o sistema xylA/xilose, de 3 variedades de laranja doce Hamlin, Valência e Natal, com uma eficiência de transformação genética variando de 1 - 3%, em função do experimento e da variedade. A atividade da enzima xilose isomerase foi confirmada pelo teste clorofenol vermelho. Esse trabalho concluiu que é possível a regeneração de plantas transgênicas de variedades de laranja doce utilizando-se o sistema de seleção positiva xylA/xilose. / The genetic improvement of the citric plants, by traditional methods, is made difficult by a series species biology reproduction characteristics. The use of modern biotechnology techniques, as tissue culture, the genetic manipulation and molecular biology, have shown attractive for the culture genetic improvement. The objective of this work was to evaluate the genetic transformation in varieties of sweet orange (Citrus sinensis) using the gene xylA as selection gene. The work was carried out with the EHA 101 Agrobacterium tumefaciens, containing the plasmid pNOV1457, whith the gene xylA. The bacterium was culture in YEP media supplemented with antibiotics (nalidixic acid, kanamicyn e streptomycin). Epicotyl segments were incubated, for 20 min, with the bacterial suspension. After inoculation, the segments were dry in a sterile paper, and incubated in a petri dish (100 x 15mm) containing the medium EME + BAP (1 mg.L-1), in dark, at the temperature of 24 °C, for a period of 3 days, with and without acetoseryngone during the co-culture period. After the co-culture, the explants were transferred to culture medium of selection and regeneration, consisting of medium EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xylose (15 mg.L-1). The genetic transformation was confirmed by the gene detection by PCR. The DNA extraction was done by Dellaporta et al. (1983). PCR reactions were done in a thermal cycler PTC-100 (MJ Research) using specific "primers" for gene xylA detection. The enzyme xilose isomerase activity was confirmed by the red clorofenol test. It is possible to regenerate sweet orange transgenic plants using the positive select system based on xylA gene, of 3 sweer orange varieties Hamlin, Valencia and Natal, with a genetic transformation efficiency of 1-3%.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-14012005-102524 |
| Date | 06 December 2004 |
| Creators | Pereira, Gustavo Alves |
| Contributors | Mendes, Beatriz Madalena Januzzi |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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