A doença do sono é um dos maiores obstáculos para o desenvolvimento das áreas rurais da África Subsaariana. O diagnóstico positivo da doença do sono, bem como o estágio em que ela se encontra, é essencial perante a severidade da doença e toxicidade dos medicamentos disponíveis para o tratamento. A eficiência do tratamento e diagnóstico depende do conhecimento do ciclo de vida, biologia do parasito e seu metabolismo. Os tripanossomatídeos possuem mecanismos conservados entre si como a expressão gênica, neste contexto o Trypanosoma brucei pode ser considerado um organismo modelo e o estudo do processamento de RNA mensageiro por splicing neste parasito pode ser extrapolado para outros tripanosomatídeos. O processo de excisão dos íntrons e junção dos éxons é chamado splicing, e tanto o cis quanto o trans-splicing são reações de transesterificação realizados pelo spliceosomo, que consiste de 5 partículas nucleares, as snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein) U1, U2, U4, U5 e U6 bem como proteínas não específicas de snRNPs. As snRNPs são complexos que consistem de pequenos RNAs ricos em uridina (U snRNAs) unidos fortemente a proteínas. São conhecidas oito proteínas específicas de U5 snRNP em humanos 220K, 200K, 116K, 102K, 100K, 52K, 40K e 15K. Foi mostrado que a U5-15K humana é essencial em diversos pontos da formação do spliceosomo. O objetivo desse trabalho foi a caracterização estrutural e da atividade de autoclivagem da proteína U5-15K de T. brucei. Essa proteína pertencente à família Dim1e é formada por 155 resíduos de aminoácido e massa molecular de 17,7 kDa. A proteína recombinante clonada no vetor de expressão pET SUMO (Invitrogen) foi expressa em E. coli por indução com IPTG e purificada por cromatografia de afinidade por íons metálico em resina de Cobalto. O produto foi usado para testes da atividade de auto-clivagem, contendo ou não inibidores de protease. A proteína pura também foi usada em estudos de suas propriedades em solução por experimentos de DLS, que mostrou uma maior homogeneidade da proteína na presença de MgCl2, DSF, que mostrou a estabilidade da U5-15K em solução com relação ao pH. As mudanças de conformação da estrutura secundária da U5-15K e U5-15K clivada foi estudada por experimentos de CD, que mostraram uma redução na porcentagem de folhas-β na estrutura terciária da U5-15K clivada, e foi construído um modelo tridimensional através da modelagem por homologia, que foi comparado com os resultados obtidos por experimentos de SAXS. Foram realizados ensaios de cristalização em diversas condições provenientes de kits comerciais com a proteína nas formas clivada e não clivada e em diferentes concentrações. Como perspectivas ficam a definição exata do ponto de clivagem por espectrometria de massas, proteólise da alça flexível para novos ensaios de cristalização e estudo das mutações nos possíveis sítios ativos e sítio de clivagem. / Sleep sickness is one the most important public health problem in the Africa and it causative agent, Trypanosma brucei, is an organism model for the study of different conserved process among the trypanosomatids. In trypanosomes, mRNAs are processed by trans-splicing, in which a common spliced leader sequence (SL) is acquired at the 5\' end of the mRNA to yield a mature transcript. RNA splicing is carried out by the spliceosome, which consists of the U1, U2, U4, U5 and U6 U snRNPs particles and non-snRNP proteins. The ribonucleoproteins are complexes that consist of small uridine-rich RNAs (U snRNAs) and interact with common Sm proteins and proteins that are specific for each snRNP. Seven U5 snRNP specific proteins are known in trypanosomes, 220K, 200K, 116K, 102K, Cwc21, 40K e 15K. The spliceosomal protein U5-15K is essential for the parasite viability and various evidences suggest participation of the member in spliceosome assembly. U5-15K presents a conserved domain dim1, its molecular weight is estimated of 17,7 kDa and 155 amino acids residues. In this work, U5-15K was cloned into pET SUMO (Invitrogen), transformed in BL21(DE3)pLysS and recombinant protein was purified by immobilized ion affinity chromatography. It was possible observe that U5-15K undergo self-cleavage, process inhibited by serine and cysteine protease inhibitors. Dynamic Light Scattering (DLS) experiments showed higher protein homogeneity in the presence of MgCl2 and Differential Scanning Fluorimetry (DSF) data demonstrated higher stability at neutral pH. Circular dichroism (CD) spectra obtained using U5-15K native and cleaved suggest a reduction in percentage of β-sheets at cleaved U5-15K secondary structure. Native and cleaved proteins at different concentrations were used in crystallization trials, however, no suitable protein crystals were observed. A tridimensional homology model for U5-15K from Trypanosoma brucei, using as template the human homologue, present a thioredoxin folding, although it has observed a possible central loop not present in the template. We intent to determine the exact cleavage point using mass spectrometry and new crystallization trials will be performed after removal of probable loops by limited proteolysis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-28042015-094727 |
| Date | 23 February 2015 |
| Creators | Lima, Ana Laura de |
| Contributors | Silva, Marco Tulio Alves da |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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