A doença do sono é um dos maiores obstáculos para o desenvolvimento das áreas rurais da África Subsaariana. O diagnóstico positivo da doença do sono, bem como o estágio em que ela se encontra, é essencial perante a severidade da doença e toxicidade dos medicamentos disponíveis para o tratamento. A eficiência do tratamento e diagnóstico depende do conhecimento do ciclo de vida, biologia do parasito e seu metabolismo. Os tripanossomatídeos possuem mecanismos conservados entre si como a expressão gênica, neste contexto o Trypanosoma brucei pode ser considerado um organismo modelo e o estudo do processamento de RNA mensageiro por splicing neste parasito pode ser extrapolado para outros tripanosomatídeos. O processo de excisão dos íntrons e junção dos éxons é chamado splicing, e tanto o cis quanto o trans-splicing são reações de transesterificação realizados pelo spliceosomo, que consiste de 5 partículas nucleares, as snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein) U1, U2, U4, U5 e U6 bem como proteínas não específicas de snRNPs. As snRNPs são complexos que consistem de pequenos RNAs ricos em uridina (U snRNAs) unidos fortemente a proteínas. São conhecidas oito proteínas específicas de U5 snRNP em humanos 220K, 200K, 116K, 102K, 100K, 52K, 40K e 15K. Foi mostrado que a U5-15K humana é essencial em diversos pontos da formação do spliceosomo. O objetivo desse trabalho foi a caracterização estrutural e da atividade de autoclivagem da proteína U5-15K de T. brucei. Essa proteína pertencente à família Dim1e é formada por 155 resíduos de aminoácido e massa molecular de 17,7 kDa. A proteína recombinante clonada no vetor de expressão pET SUMO (Invitrogen) foi expressa em E. coli por indução com IPTG e purificada por cromatografia de afinidade por íons metálico em resina de Cobalto. O produto foi usado para testes da atividade de auto-clivagem, contendo ou não inibidores de protease. A proteína pura também foi usada em estudos de suas propriedades em solução por experimentos de DLS, que mostrou uma maior homogeneidade da proteína na presença de MgCl2, DSF, que mostrou a estabilidade da U5-15K em solução com relação ao pH. As mudanças de conformação da estrutura secundária da U5-15K e U5-15K clivada foi estudada por experimentos de CD, que mostraram uma redução na porcentagem de folhas-β na estrutura terciária da U5-15K clivada, e foi construído um modelo tridimensional através da modelagem por homologia, que foi comparado com os resultados obtidos por experimentos de SAXS. Foram realizados ensaios de cristalização em diversas condições provenientes de kits comerciais com a proteína nas formas clivada e não clivada e em diferentes concentrações. Como perspectivas ficam a definição exata do ponto de clivagem por espectrometria de massas, proteólise da alça flexível para novos ensaios de cristalização e estudo das mutações nos possíveis sítios ativos e sítio de clivagem. / Sleep sickness is one the most important public health problem in the Africa and it causative agent, Trypanosma brucei, is an organism model for the study of different conserved process among the trypanosomatids. In trypanosomes, mRNAs are processed by trans-splicing, in which a common spliced leader sequence (SL) is acquired at the 5\' end of the mRNA to yield a mature transcript. RNA splicing is carried out by the spliceosome, which consists of the U1, U2, U4, U5 and U6 U snRNPs particles and non-snRNP proteins. The ribonucleoproteins are complexes that consist of small uridine-rich RNAs (U snRNAs) and interact with common Sm proteins and proteins that are specific for each snRNP. Seven U5 snRNP specific proteins are known in trypanosomes, 220K, 200K, 116K, 102K, Cwc21, 40K e 15K. The spliceosomal protein U5-15K is essential for the parasite viability and various evidences suggest participation of the member in spliceosome assembly. U5-15K presents a conserved domain dim1, its molecular weight is estimated of 17,7 kDa and 155 amino acids residues. In this work, U5-15K was cloned into pET SUMO (Invitrogen), transformed in BL21(DE3)pLysS and recombinant protein was purified by immobilized ion affinity chromatography. It was possible observe that U5-15K undergo self-cleavage, process inhibited by serine and cysteine protease inhibitors. Dynamic Light Scattering (DLS) experiments showed higher protein homogeneity in the presence of MgCl2 and Differential Scanning Fluorimetry (DSF) data demonstrated higher stability at neutral pH. Circular dichroism (CD) spectra obtained using U5-15K native and cleaved suggest a reduction in percentage of β-sheets at cleaved U5-15K secondary structure. Native and cleaved proteins at different concentrations were used in crystallization trials, however, no suitable protein crystals were observed. A tridimensional homology model for U5-15K from Trypanosoma brucei, using as template the human homologue, present a thioredoxin folding, although it has observed a possible central loop not present in the template. We intent to determine the exact cleavage point using mass spectrometry and new crystallization trials will be performed after removal of probable loops by limited proteolysis.

A doença do sono é um dos maiores obstáculos para o desenvolvimento das áreas rurais da África Subsaariana. O diagnóstico positivo da doença do sono, bem como o estágio em que ela se encontra, é essencial perante a severidade da doença e toxicidade dos medicamentos disponíveis para o tratamento. A eficiência do tratamento e diagnóstico depende do conhecimento do ciclo de vida, biologia do parasito e seu metabolismo. Os tripanossomatídeos possuem mecanismos conservados entre si como a expressão gênica, neste contexto o Trypanosoma brucei pode ser considerado um organismo modelo e o estudo do processamento de RNA mensageiro por splicing neste parasito pode ser extrapolado para outros tripanosomatídeos. O processo de excisão dos íntrons e junção dos éxons é chamado splicing, e tanto o cis quanto o trans-splicing são reações de transesterificação realizados pelo spliceosomo, que consiste de 5 partículas nucleares, as snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein) U1, U2, U4, U5 e U6 bem como proteínas não específicas de snRNPs. As snRNPs são complexos que consistem de pequenos RNAs ricos em uridina (U snRNAs) unidos fortemente a proteínas. São conhecidas oito proteínas específicas de U5 snRNP em humanos 220K, 200K, 116K, 102K, 100K, 52K, 40K e 15K. Foi mostrado que a U5-15K humana é essencial em diversos pontos da formação do spliceosomo. O objetivo desse trabalho foi a caracterização estrutural e da atividade de autoclivagem da proteína U5-15K de T. brucei. Essa proteína pertencente à família Dim1e é formada por 155 resíduos de aminoácido e massa molecular de 17,7 kDa. A proteína recombinante clonada no vetor de expressão pET SUMO (Invitrogen) foi expressa em E. coli por indução com IPTG e purificada por cromatografia de afinidade por íons metálico em resina de Cobalto. O produto foi usado para testes da atividade de auto-clivagem, contendo ou não inibidores de protease. A proteína pura também foi usada em estudos de suas propriedades em solução por experimentos de DLS, que mostrou uma maior homogeneidade da proteína na presença de MgCl2, DSF, que mostrou a estabilidade da U5-15K em solução com relação ao pH. As mudanças de conformação da estrutura secundária da U5-15K e U5-15K clivada foi estudada por experimentos de CD, que mostraram uma redução na porcentagem de folhas-β na estrutura terciária da U5-15K clivada, e foi construído um modelo tridimensional através da modelagem por homologia, que foi comparado com os resultados obtidos por experimentos de SAXS. Foram realizados ensaios de cristalização em diversas condições provenientes de kits comerciais com a proteína nas formas clivada e não clivada e em diferentes concentrações. Como perspectivas ficam a definição exata do ponto de clivagem por espectrometria de massas, proteólise da alça flexível para novos ensaios de cristalização e estudo das mutações nos possíveis sítios ativos e sítio de clivagem. / Sleep sickness is one the most important public health problem in the Africa and it causative agent, Trypanosma brucei, is an organism model for the study of different conserved process among the trypanosomatids. In trypanosomes, mRNAs are processed by trans-splicing, in which a common spliced leader sequence (SL) is acquired at the 5\' end of the mRNA to yield a mature transcript. RNA splicing is carried out by the spliceosome, which consists of the U1, U2, U4, U5 and U6 U snRNPs particles and non-snRNP proteins. The ribonucleoproteins are complexes that consist of small uridine-rich RNAs (U snRNAs) and interact with common Sm proteins and proteins that are specific for each snRNP. Seven U5 snRNP specific proteins are known in trypanosomes, 220K, 200K, 116K, 102K, Cwc21, 40K e 15K. The spliceosomal protein U5-15K is essential for the parasite viability and various evidences suggest participation of the member in spliceosome assembly. U5-15K presents a conserved domain dim1, its molecular weight is estimated of 17,7 kDa and 155 amino acids residues. In this work, U5-15K was cloned into pET SUMO (Invitrogen), transformed in BL21(DE3)pLysS and recombinant protein was purified by immobilized ion affinity chromatography. It was possible observe that U5-15K undergo self-cleavage, process inhibited by serine and cysteine protease inhibitors. Dynamic Light Scattering (DLS) experiments showed higher protein homogeneity in the presence of MgCl2 and Differential Scanning Fluorimetry (DSF) data demonstrated higher stability at neutral pH. Circular dichroism (CD) spectra obtained using U5-15K native and cleaved suggest a reduction in percentage of β-sheets at cleaved U5-15K secondary structure. Native and cleaved proteins at different concentrations were used in crystallization trials, however, no suitable protein crystals were observed. A tridimensional homology model for U5-15K from Trypanosoma brucei, using as template the human homologue, present a thioredoxin folding, although it has observed a possible central loop not present in the template. We intent to determine the exact cleavage point using mass spectrometry and new crystallization trials will be performed after removal of probable loops by limited proteolysis.

A estabilidade genômica é condição essencial à sobrevivência e ao funcionamento dos organismos vivos. No entanto, várias situações podem provocar danos no DNA. Por exemplo, cerca de 104 lesões podem ocorrer no material genético de uma célula de mamífero a cada dia. No intuito de preservar a integridade genômica e contornar os efeitos deletérios destas modificações, uma maquinaria constituída de proteínas especializadas em reconhecer e reparar estes danos foi selecionada ao longo do curso evolutivo. Defeitos em proteínas destas maquinarias causam instabilidade genômica e pode resultar em elevada taxa de mutações e quebras do DNA que resultam em eventos de amplificação gênica, como em células cancerosas. De uma maneira aparentemente contrária ao requerimento de estabilidade genômica como condição primordial para a perpetuação da vida, Leishmania apresenta um genoma notavelmente maleável e explora a amplificação gênica como recurso de sobrevivência. Ainda que a plasticidade genômica em Leishmania seja facilmente demonstrada, nós não conhecemos os mecanismos precisos pelos quais este parasita coordena a ação da maquinaria de detecção de danos no DNA e a consumação dos eventos de amplificação gênica. No intuito de contribuir para a compreensão deste processo, nós identificamos proteínas homólogas do complexo 9-1-1 (Rad9-Hus1-Rad1) em Leishmania major. As proteínas LmHus1 e LmRad9 apresentam marcada divergência estrutural em relação aos seus homólogos em outros eucariotos e nenhuma proteína obviamente homóloga a Rad1 foi identificada neste parasita. Análises filogenéticas indicam que LmHus1 e LmRad9 são relacionadas ao complexos heterotriméricos envolvidos na detecção de danos no DNA. Em acordo com isso, nossos experimentos demonstram que alteração nos níveis destas proteínas interfere na capacidade do parasita em lidar com estresse genotóxico. LmHus1 localiza-se no núcleo, é requerida para o crescimento normal deste parasita e a diminuição de sua expressão compromete mecanismos de controle de ciclo celular e manutenção de telômeros. LmRad9 também localiza-se no núcleo e sua superexpressão causa defeito de crescimento e de resposta ao estresse genotóxico em L. major. Nós observamos que LmHus1 e LmRad9 formam um complexo responsivo ao dano no DNA in vivo, uma forte indicação de que o complexo 9-1-1 tenha sido conservado em L. major. As peculiaridades estruturais destas proteínas sugerem que o complexo 9-1-1 de L. major possua uma arquitetura distinta em comparação aos eucariotos superiores. Em adição a isto, outras proteínas, tais como a LmRpa1, também apresentam uma marcante divergência estrutural. Isso sugere que a via de sinalização de danos no DNA envolvendo o complexo 9-1-1 e Rpa1 de L. major possua mecanismos peculiares de ação. Estas observações podem permitir entender como ocorreu o processo evolutivo da sinalização mediada pelo complexo 9-1-1 nos eucariotos, além de ajudar para o entendimento das bases moleculares de como este parasito conduz os eventos de amplificação gênica. / Genome stability is a essential condition for survival and proper functioning of living organisms. However, a broad range of elements may lead to DNA damage. For instance, about 104 DNA lesions may be inflicted upon any given mammalian cell everyday. In order to maintain the genome integrity and circumvent the deleterious effects of these lesions, a molecular machinery composed of proteins specialized in detecting and repairing DNA damage has been selected in evolution. Defects of the proteins that constitute such machineries may result not only in a high mutation rate, but also in breaks in the DNA structure that can mediate gene amplification as observed in cancer cells. In an apparent opposition to such requirement for stability as an essential condition to life, the protozoan Leishmania presents a highly malleable genome and explores genome amplification as a survival and adaptation tool. Despite of the fact that the Leishmania genome plasticity can be easily demonstrated, the precise mechanisms that coordinate the molecular machineries involved in the detection and signaling of DNA damage, and in the regulation of gene amplification is still largely unknown. In order to contribute to a better understanding of these processes, we identified and studied the Leishmania major proteins that are homologues of those proteins that compose the 9-1-1 complex (Rad9-Hus1-Rad1). The proteins LmHus1 and LmRad9 present a high structural divergence when compared to its homologues from other eukaryotes and no obvious homologue of Rad1 was identified in the parasite genome. Phylogeny analysis indicated that LmHus1 and LmRad9 are closely related to heterotrimeric complexes involved in the detection of DNA damage. In accordance to that, our experiments demonstrated that altered levels of these proteins interfere with the parasite ability to deal with genotoxic stress. Moreover, LmHus1 was localized to the parasite nucleus and is a required protein for normal parasite proliferation. Besides, we showed that decreased levels of LmHus1 compromise cell cycle regulation and the maintenance of telomeres. LmRad9 was also shown to be localized to the cell nucleus and its overexpression led to growth defects and affected the L. major response to genotoxic stress. We also observed that LmHus1 and LmRad9 interact with each other to for a protein complex that is responsive to DNA damage in vivo, which strongly suggested that the 9-1-1 complex was conserved in L. major. The structural peculiarities of these proteins indicate that the possible L. major 9-1-1 complex has a different architecture when compared to the complex found in higher eukaryotes. In addition to that, other proteins, such as LmRpa1, also present a marked structural divergence. Altogether, these findings suggest that the DNA damage signaling pathway involving the 9-1-1 complex and LmRpa1 in L. major, may present a peculiar mode of action. These observations may contribute to a better understanding not only of the evolution of the signaling pathway mediated by the 9-1-1 complex in eukaryotes, but also of the molecular basis of the genome plasticity and the gene amplification phenomenon.

A estabilidade genômica é condição essencial à sobrevivência e ao funcionamento dos organismos vivos. No entanto, várias situações podem provocar danos no DNA. Por exemplo, cerca de 104 lesões podem ocorrer no material genético de uma célula de mamífero a cada dia. No intuito de preservar a integridade genômica e contornar os efeitos deletérios destas modificações, uma maquinaria constituída de proteínas especializadas em reconhecer e reparar estes danos foi selecionada ao longo do curso evolutivo. Defeitos em proteínas destas maquinarias causam instabilidade genômica e pode resultar em elevada taxa de mutações e quebras do DNA que resultam em eventos de amplificação gênica, como em células cancerosas. De uma maneira aparentemente contrária ao requerimento de estabilidade genômica como condição primordial para a perpetuação da vida, Leishmania apresenta um genoma notavelmente maleável e explora a amplificação gênica como recurso de sobrevivência. Ainda que a plasticidade genômica em Leishmania seja facilmente demonstrada, nós não conhecemos os mecanismos precisos pelos quais este parasita coordena a ação da maquinaria de detecção de danos no DNA e a consumação dos eventos de amplificação gênica. No intuito de contribuir para a compreensão deste processo, nós identificamos proteínas homólogas do complexo 9-1-1 (Rad9-Hus1-Rad1) em Leishmania major. As proteínas LmHus1 e LmRad9 apresentam marcada divergência estrutural em relação aos seus homólogos em outros eucariotos e nenhuma proteína obviamente homóloga a Rad1 foi identificada neste parasita. Análises filogenéticas indicam que LmHus1 e LmRad9 são relacionadas ao complexos heterotriméricos envolvidos na detecção de danos no DNA. Em acordo com isso, nossos experimentos demonstram que alteração nos níveis destas proteínas interfere na capacidade do parasita em lidar com estresse genotóxico. LmHus1 localiza-se no núcleo, é requerida para o crescimento normal deste parasita e a diminuição de sua expressão compromete mecanismos de controle de ciclo celular e manutenção de telômeros. LmRad9 também localiza-se no núcleo e sua superexpressão causa defeito de crescimento e de resposta ao estresse genotóxico em L. major. Nós observamos que LmHus1 e LmRad9 formam um complexo responsivo ao dano no DNA in vivo, uma forte indicação de que o complexo 9-1-1 tenha sido conservado em L. major. As peculiaridades estruturais destas proteínas sugerem que o complexo 9-1-1 de L. major possua uma arquitetura distinta em comparação aos eucariotos superiores. Em adição a isto, outras proteínas, tais como a LmRpa1, também apresentam uma marcante divergência estrutural. Isso sugere que a via de sinalização de danos no DNA envolvendo o complexo 9-1-1 e Rpa1 de L. major possua mecanismos peculiares de ação. Estas observações podem permitir entender como ocorreu o processo evolutivo da sinalização mediada pelo complexo 9-1-1 nos eucariotos, além de ajudar para o entendimento das bases moleculares de como este parasito conduz os eventos de amplificação gênica. / Genome stability is a essential condition for survival and proper functioning of living organisms. However, a broad range of elements may lead to DNA damage. For instance, about 104 DNA lesions may be inflicted upon any given mammalian cell everyday. In order to maintain the genome integrity and circumvent the deleterious effects of these lesions, a molecular machinery composed of proteins specialized in detecting and repairing DNA damage has been selected in evolution. Defects of the proteins that constitute such machineries may result not only in a high mutation rate, but also in breaks in the DNA structure that can mediate gene amplification as observed in cancer cells. In an apparent opposition to such requirement for stability as an essential condition to life, the protozoan Leishmania presents a highly malleable genome and explores genome amplification as a survival and adaptation tool. Despite of the fact that the Leishmania genome plasticity can be easily demonstrated, the precise mechanisms that coordinate the molecular machineries involved in the detection and signaling of DNA damage, and in the regulation of gene amplification is still largely unknown. In order to contribute to a better understanding of these processes, we identified and studied the Leishmania major proteins that are homologues of those proteins that compose the 9-1-1 complex (Rad9-Hus1-Rad1). The proteins LmHus1 and LmRad9 present a high structural divergence when compared to its homologues from other eukaryotes and no obvious homologue of Rad1 was identified in the parasite genome. Phylogeny analysis indicated that LmHus1 and LmRad9 are closely related to heterotrimeric complexes involved in the detection of DNA damage. In accordance to that, our experiments demonstrated that altered levels of these proteins interfere with the parasite ability to deal with genotoxic stress. Moreover, LmHus1 was localized to the parasite nucleus and is a required protein for normal parasite proliferation. Besides, we showed that decreased levels of LmHus1 compromise cell cycle regulation and the maintenance of telomeres. LmRad9 was also shown to be localized to the cell nucleus and its overexpression led to growth defects and affected the L. major response to genotoxic stress. We also observed that LmHus1 and LmRad9 interact with each other to for a protein complex that is responsive to DNA damage in vivo, which strongly suggested that the 9-1-1 complex was conserved in L. major. The structural peculiarities of these proteins indicate that the possible L. major 9-1-1 complex has a different architecture when compared to the complex found in higher eukaryotes. In addition to that, other proteins, such as LmRpa1, also present a marked structural divergence. Altogether, these findings suggest that the DNA damage signaling pathway involving the 9-1-1 complex and LmRpa1 in L. major, may present a peculiar mode of action. These observations may contribute to a better understanding not only of the evolution of the signaling pathway mediated by the 9-1-1 complex in eukaryotes, but also of the molecular basis of the genome plasticity and the gene amplification phenomenon.