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Dissertação de Mestrado - Carolina C B Gruszkowski.pdf: 2705318 bytes, checksum: f07dc28b794bcd1bd613cf1fad937d4a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-29T13:11:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1
Dissertação de Mestrado - Carolina C B Gruszkowski.pdf: 2705318 bytes, checksum: f07dc28b794bcd1bd613cf1fad937d4a (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os métodos de diagnóstico usados hoje para a Doença de Chagas, embora simples e de baixo
custo, podem apresentar baixas sensibilidade e especificidade ou reações cruzadas com outros patógenos. Da mesma forma, os medicamentos usados no tratamento apresentam severos efeitos colaterais. Dentre os vários alvos metabólicos sugeridos, as proteases têm sido apontadas como moléculas candidatas devido às suas particularidades.Recentemente o nosso grupo identificou duas aspartil proteases em T. cruzi: uma solúvel (Cruzipsina-Il) e outra membranar (Cruzipsina-I); entretanto, suas funções biológicas permaneceram desconhecidas. Os nossos resultados demonstram, pela 1 a vez, a existência de um complexo proteolítico membranar em T. cruzi com propriedades similares ao complexo y-secretase de outras células eucarióticas. Usando ferramentas de bioinformática localizamos em banco de dados as seqüências primárias de 3 das 4 proteínas do complexo (presenilina, nicastrina e Aph-l). Esta informação foi importante para caracterizarmos através de síntese paralela de peptídeos os epitopos B lineares das 3 proteínas usando soros de pacientes. A presenilina apresentou 10 epitopos majoritários, a nicastrina, 5 e a Aph-l, 10. Alguns epitopos foram selecionados por vários critérios e anticorpos anti-peptídeos obtidos em coelhos. O soro anti-peptídeo PRE-2 de presenelina identificou por immunoblotting a banda de 48 kDa na fração CZP-I como sendo presenelina, enquanto o soro anti-peptideo NIC-l de nicastrina apresentou também uma marcação na mesma posição. A análise por microscopia confocal em epimastigotas localizou as proteínas predominantemente nas regiões anterior e mediana das células. Além disso, as marcações mostraram-se mais fortes em células permeabilizadas, sugerindo a co-localização de ambas as proteínas nas membranas internas da célula. Um teste de ELISA empregando 4 peptídeos sintéticos da presenilina e nicastrina de T. cruzi apresentou sensibilidade e especificidade de 71,59% e 70,53%, respectivamente. Utilizando a extração diferencial com detergente e análise por EGPA-SDS após cromatografia de afinidade, confirmamos na cepa CL Brener de T. cruzi o perfil de bandas presentes na cepa Y, de 240, 56, 48 e 34 kDa na fração CZP-I (detergente) e 56, 52, 37 e 34 kDa na fração CZP-I1 (solúvel). Ensaios
enzimáticos usando o inibidor L-685,458 e moduladores alostéricos DAPT e Composto
XXIIE da presenilina humana sugeriram que aparentemente o sítio catalítico da presenilina de T. cruti possui uma constituição semelhante. ao da presenilina humana, enquanto diferenças significativas puderam ser observadas no sitio alostérico. O inibidor de sítio ativo L-685,458 foi capaz de inibir 100% da atividade enzimática em 5!-lM, enquanto os moduladores DAPT e Composto XXIIE não apresentaram uma inibição significativa. Portanto, os nossos estudos sugerem que devido as suas funções enzimáticas e localização celular a presenilina do T. cruzi é um bom alvo quirnioterapêutico e imunológico. / The diagnostic methods used today for Chagas disease, although simple and unexpensive,
may present low sensitivity and specificity or cross-reactions with other pathogens. Likewise, drugs used nowadays to treat Chagas disease show severe side effects. Among the various metabolic targets suggested, proteases have been identified as candidate molecules due to its particularities. Recently our group identified two aspartyl proteases in T. cruzi: a soluble (Cruzipsin-I1) and a membrane-bound (Cruzipsin-l); however, their biological functions remained unknown. Our results demonstrate for the 1 st time, the existence of a membrane proteolytic complex in T. cruzi with similar properties to the y-secretase complex of other eukaryotic cells. Using bioinformatics tools, the primary sequences of three of four complex
proteins (presenilin, nicastrin and Aph-l) where localized at a protein database. This
information was important for parallel synthesis of peptides and the identification of linear epitopes of proteins using sera from eight patients. Presenilin presented 10 major epitopes, nicastrina,5 and Aph-l, 10. Some epitopes were selected by different criteria and anti-peptide sera were obtained in rabbits. Serum anti-peptide PRE-2 of presenelin .identified by immunoblotting a 48 kDa band in fraction CZP-I as presenelin, while the anti-peptide NIC-I of nicastrin also presented a marking in the same position. Analysis by confocal microscopy
of epimastigotes localized the proteins mainly at anterior and middle portions of the cells. ln addition, the markings were found to be stronger in permeabilized cells, suggesting co- localization of both proteins in the inner membranes of the cell. An ELISA employing four synthetic peptides for T. cruzi presenilin and nicastrin presented sensitivity of 71.59% and specificity and 70.53%. USlng differential detergent extraction and analysis by SDS-PAGE
after affinity chromatography confirmed that the profile bands present in the strain CL Brener were like those of strain Y: 240, 56, 48 and 34 kDa in fraction CZP-I (detergent), and 56, 52, 37 and 34 kDa in CZP-I1 fraction (solub1e). Enzyme assays using the inhibitor L-685,458 and allosteric modulators DAPT and Compound XXI/E of human presenilin apparently suggested that the catalytic site of T. cruri presenilin has a constitution similar to the human presenilin, while significant differences were observed in the allosteric site. The active site inhibitor L-685,458 was able to inhibit 100% of enzyme activity at 5 !J.M, while the modulators DAPT and Compound XXI/E showed no significant inhibition. Therefore, our studies suggest that due to their enzymatic functions and cellular localization the presenilin of T. cruzi is a good
target for chemotherapeutic and for immune system.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/7213 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Gruszkowski, Carolina Conceição Bottino |
| Contributors | Pinho, Rosa Teixeira, Bourguignon, Saulo Cabral, Guedes, Maria Izabel Florindo, Lopez, Raquel Elisa da Silva, Bou Habib, Elvira Maria S. C., Simone, Salvatore Giovanni de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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