Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T23:09:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2000 / Resumo: As serpentes do gênero Bothrops incluem várias espécies, que são amplamente distribuídas na América do Sul e do Norte. Entre as proteínas bioativas do veneno de Bothrops, as Fosfolipases Az (PLAz,E.c. 3.1.14) e as miotoxinas PLAz"like" destacam-se como seus componentes majoritários. Fosfolipases Az são enzimas cálcio dependentes que hidrolisam a ligação 2-éster do 1,2 diacil-3sn fosfoglicerídeo (Chang et aI., 1994, Shimohigachi et aI., 1995, Ogawa, et aI., 1996). Estas enzimas são encontradas em muitos tecidos, principalmente no suco pancrácio de mamíferos,no veneno de serpentes e insetos. Enzimas PLAz são classificados dentro de quatro grupos (I, lI, III e IV) de acordo com sua origem extracelular ou intracelular, de acordo com sua estrutura primária e pontes de sulfeto (Denis et aI., 1994). Nesta tese, trabalhos com o veneno total de Bothrops pirajai e suas frações fosfolipases Az miotóxicas. Num primeiro instante, nos desenvolvemos uma nova estratégia de purificaçãodestas miotoxinasem HPLC(HPLCde fase reversa, troca iônicae exclusão molecular) e em cromatografia convencional de baixa pressão (CM-Sepharose). Em nossas condições experimentais, observamos que o HPLCde fase reversa (RP HPLC)tem vantagens sobre o método convencional, em relação ao tempo da corrida cromatográfica, a resolução dos picos e a manutenção da integridade molecular da PLAz.
O primeiro trabalho feito por Toyama et aI., (1995) apresenta os resultados da purificação da principal miotoxina PLAz"Iike" (MPI e MPII) do veneno total de Bothrops pirajai, usando uma única etapa cromatográfica em HPLCde fase reversa. Este novo protocolo de purificação restringe a quantidade de proteína a ser colocada na coluna algumas mg. O rendimento final é 35% melhor do que na cromatografia de troca iônica
de baixa pressão. Em Soares et aI., (1998), propusemos um uma outra alternativa de purificação das miotoxinas PLAz "like" majoritárias usando coluna convencional, uma vez que o RP HPLC não aceita grandes quantidades de amostras. No procedimento convencional,a eluição
das miotoxinasPLAz"like" era eluídausando acetato de amônia em altas concentraçõe se altos valor de pH. Atroca do acetato de amônio por bicarbonato de amônia permitiu o uso de tampões com baixo pH e baixas concentrações salinas. Outros venenos de Bothrops jararacussu, Bothrops asper, Bothrops atrox, Bothrops pirajai, Bothrops moojeni, Bothrops alternatus e Bothrops (Bothriopsis) bilineata foram
fracionados usando procedimentos simplificados baseados na cromatografia em CMSepharose a pH 8.0 ou em RP HPLC. O uso de NH4HC03ou de acetonitrila como tampões nestes procedimentos cromatográficosdescritos acima, tem outras vantagens como a omissãode desalificaçãoe
facilidadena liofilização. Isto permite uma melhorrecuperação das proteínas eluídas e redução do tempo de corrida. O método em CM-Sepharosee RP-HPLCdescritos aqui são recomendados para escalas preparativas e analíticas, respectivamente. Nos métodos previamente descritos
usam dois ou mais passos cromatográficos para o isolamento de miotoxinas. Em adição as colunas preparativas wBondapack C18 mostraram também ser conveniente para a purificação de PLA2S. Ambos os métodos descritos aqui separam os componentes principaisdo veneno usando unicamente passo cromatográfico. Os perfis cromatográficos mostraram importantes diferenças no conteúdo de miotoxinas destes venenos. O veneno de B. alternatus, B. atrox e Bothriopsis bilineata não contem a miotoxina principal encontrada em outros venenos. O sequenciamento de
aminoácidos dos primeiros 50 resíduos da região N-terminal destas miotoxinas PLA2"like" mostram uma homologia de 90 a 96% com outras miotoxinas botropicas. Todas as miotoxinas isoladas induzem edema de pata, aumentando o nível de creatinina quinase pancreática e indução da mionecrose junto com a infiltraçãode células polimorfonucleares. Nesta tese, nos apresentamos o isolamento, purificação e a determinação da
estrutura primária de três miotoxinas fosfolipase A2"like" do veneno de Bothrops pirajai, denominadas como PrTX-I,PrTX-IIe MP-III4R.
PrTX-I ou Piratoxina I foi isolado por Mancuso et ai., (1995), e completamente seqüênciada por Toyama et ai., (1998). PrTX-Ié a principal PLA2 miotóxica encontrado no veneno total de Bothrops pirajai, composto por 121 resíduos de aminoácidos, uma DLso de cerca de 8mg/kg em camundongos e uma dose edematogênica mínima de 39.5 :t 1.8 Ilg. A modificação química da His 48 da PrTX-I pelo p-BPB praticamente aboliu sua atividade biológica. PrTX-II ou Piratoxina II foi a segunda miotoxina importante isolada do veneno de Bothrops pirajai que foi sequenciada por Toyama et aI., (1999, submetido). Tem 121 resíduos de aminoácido de baixa atividade PLA2 devido substituição do Asp49 por Lys49e
alteração do "Ioop" de ligação do cálcio pela substituição de Gly32 por Leu32 e outras modificações foram importantes para a perda da flexibilidadedo sítio de ligação do cálcio. PrTX-II tem somente um único amino ácido modificado (D132 para A132) em relação a
PrTX-I esta mudança confere a PrTX-II um ligeiro caráter básico. A MP-III 4R foi a terceira miotoxina isolada do veneno de Bothrops pirajai. Esta
miotoxina PLA2 "Iike" tem uma atividade PLA2moderada se comparada com outras enzimas encontradas em venenos Crotálicos. MP-III4R é um raro exemplode PLA2 com atividade fosfolipase A2, anticoagulante e miotóxica. Sua atividade PLA2 moderada é devido a substituição do resíduo E53 pelo K53 e seu efeito anticoagulante é devido a atividade PLA2.Amiotoxicidade não é devido a sua atividade catalítica. O alinhamento de amino ácidos da PrTX-I,PrTX-II mostra um alto nível (95%) de homologia sequencial entre esta miotoxina e outras PLA2botropicas. Contudo, estes valores diminuem para 80% para as não botropicas e para 70-75% para as PLA2Asp49. Ambas toxinas foram caracterizadas como miotoxinas potentes e tem um atividade PLA2 residual. MP-III 4R mostra uma homologia seqüencial de mais de 50% com outras PLA2
D-49. Maso alinhamento de aminoácidos da MP-III4R com PLA2K-49diminui para cerca de 60% de homologia. PrTX-II e PrTX-III foram cristalizados e difratados usando uma resulução de 2.04 e 2.7 A. Recentemente, a estrutura tridimensional da PrTX-IIfoi resolvida e mostrou uma
estrutura dimérica / Abstract: The genus Bothrops comprises severaI species, which are widely distributed in South and North America. Among the bioactive proteins from Bothrops venoms, the phospholipase A2(PLA2,E.C.3.1.14) and PLA2-likemyotoxin are outstanding as their major components. Phospholipase A2Sare calcium-dependent enzymes which hydrolyze the 2 ester bonds of 1,2 diacyl-3sn phosphoglycerides (Chang et aI., 1994, Shimohigachi et aI., 1995, Ogawa, et aI., 1996). They are found in most tissues, mainly in the pancreatic juice of mammals, venom of snakes and insects. PLA2enzymes are classified onto four groups (I, II, III and IV), according to their extracellular or intracellular origin, their primary structure and disulfide bonding (Denis et aI., 1994). In this thesis, we work with Bothrops pirajai whole venom and its myotoxic
phospholipase A2fractions. At first time, we develop a new strategy of purification of this myotoxinon the HPLC(reverse phase, ion exchange, and molecular exclusion) and in the convention low-pressure chromatography (CM-Sepharose). In our experimental condition, we observed that Reverse Phase HPLC(RP HPLC) has advantageous on the conventional method about the time of chromatographic run, the resolution of some proteins and preservation of integrity of PLA2 molecule. The first work made by Toyama et aI., (1995) presents the results of the purification
of the main myotoxin PLA2"Iike" (MPI and MPII) from the whole venom of Bothrops piraja.,using only chromatographicstep on the RPHPLC. This novel purification protocol restricts the amount of protein to be loaded on each column in few mg. The final yield is 35% better than to in low-pressure ion exchange chromatography. In the Soares et aI., (1998), we proposed to increase the purification grade of main
PLA2 "like" myotoxin using conventional column, because the RP HPLC does not accept great amount of samples. In the conventional procedure, the elution of the PLA2 "like" myotoxin was eluted using ammonium acetate at high salt and pH values. The exchange of the ammonium acetate by ammonium bicarbonate allowed using low pH and ionic salt concentration. PrTX-II or Piratoxin II was a second important myotoxin from Bothrops pirajai that has been sequecianated by Toyama (Submitted). It has 121 amino acid residues and has low PLA2activity arose of the substitution of Asp49 by Lys49and alteration of the calcium binding loop sequence by replacement of Gly32 by Leu32 and other modification were important for 1055of the flexibility the calcium ion binding site. PrTX-II I have only one amino acid change (0132 to A132) to PrTX-I, this change confer to PrTX-II a slight basic character. The MP-III 4R was thirty myotoxin isolated from the Bothrops pirajai venom. This
PLA2 like myotoxinhasa moderate PLA2activity if comparedto other enzymesfound in the Crotalic venom. MP-III 4R is a rare example of PLA2 with phospholipase A2, anticoagulant and myotoxic activities. Its moderate PLA2activity is due to the replacement of E53 by K53 and its anticoagulant effects is due to that PLA2activity. The myotoxicity is not due to the catalytic activity. The aminoacid alignment of PrTX-I, PrTX-II shows a high levei(95%) of sequential homology between this myotoxin and other bothropic Lys-49 PLA2. However, these values
fali to 80% for nonbothropic and to 70-75% for the Asp 49 PLA2S. 80th toxins were characterized as very potent myotoxin and have a residual PLA2 activity. MP-III 4R 049 exhibit a sequence homology with other 0-49 PLA2up 75%. But the amino acid alignment
of MP-III 4R with K-49 PLA2falls to around 60% of homology. PrTX-II and PrTX-III were crystallizedand were diffractedat resolution of 2.04 and 2.7 of resolution, respectively. Recently, the three-dimensional structure of PrTX-II was solved and showed a dimeric structure. Other venoms from Bothropsjararacussu, Bothrops asper, Bothrops atrox, Bothrops pirajai, Bothrops moojeni, Bothrops alternatus and Bothrops (Bothriopsis) bilineata were fractionated using a simplified procedure based on ion-exchange chromatography on CMSepharose at pH 8.0 or reverse phase HPLC. The use of NH4HCO3or acetonitrile as the buffer in these chromatographic procedure described above, has other advantages as omissionof desalting and easy for freeze-drying. This allows a best recoveryof the proteins eluted and reduction of run time. The CM-Sepharose and the RP-HPLC methods described here are recommended for preparative and analytical purpose, respectively. Previous reported methods use two or more chromatographic steps for the isolation of myotoxins. In addition, the preparative WBondapackC18 column was also useful for the purificationof PLA2S. Both methods described here allow separating the major components of the venom using an only one chromatographic step. The resulting elution profiles showed important differences in the myotoxin content of these venoms. The venoms from B. alternatus, B. atrox and Bothriopsis bilineata did not contain the major myotoxin found in the other venoms. The amino acid sequence of the first 50 residues of the N-terminal region of the PLA2-like myotoxins showed a homology of 90-96% with other botropic myotoxins. All of the myotoxins isolated induced rat paw edema, increased the levei of plasma creatine kinase and produced myonecrosis together with polymorphonuclear cell infiltration. In this thesis, we present the isolation; purification and determination of primary structure of three phospholipase A2"like" myotoxin from the Bothrops pirajai snake venom denominated as PrTX-I, PrTX-II and MP-III 4R. PrTX-I or Piratoxin I was firstly isolated by Mancuso et aI., (1995), and full sequenced by Toyama et aI., (1998). PrTX-Iis the main miotoxic PLA2found in the whole Bothrops pirajai venom, composed by 121 amino acid residues, a DLso around 8mg/kg in mice and a minimal edematogenic dose of 39.5 :t 1.8 /.lg. The chemical modification of His-48 of PrTX-I by p-BPB practically destroyed its biological activity / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/314663 |
| Date | 17 February 2000 |
| Creators | Toyama, Marcos Hikari |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Marangoni, Sérgio, 1951-, Carneiro, Everardo Magalhães, Antunes, Edson, Novello, Jose Camillo, Polikarpov, Igor |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Funcional e Molecular |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 98p. : il., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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