Da interação da actina com a miosina resulta a contração muscular. Esta interação é controlada pela concentração de íons cálcio, que atuam sobre um sistema regulatório associado ao filamento de actina. O sistema regulatório é composto de uma molécula de tropomiosina e um complexo protéico composto de três polipeptídeos chamado troponina. Uma das subunidades, troponina C, e o receptor de ions cálcio; outra, troponina T, liga-se à tropomiosina; e a terceira, troponina I, é a responsável pela inibição da atividade ATPásica da actomiosina. Esta dissertação descreve o desenvolvimento do processo de expressão da troponina I em bactéria, sua purificação e caracterização. Partindo de um cDNA de troponina I músculo esquelético de galinha, procedemos à construção de um vetor de expressão da proteína em E.coli com o sistema pET. Inicialmente construímos um vetor de expressão capaz de produzir a troponina I fundida a 18 aminoácidos. A proteína foi purificada e caracterizada, comportando-se de forma semelhante à troponina I selvagem. Numa segunda etapa, foram feitas mutações sítio-dirigidas para a construção de um novo sítio de restrição que possibilitou construir um vetor de expressão da troponina I a partir de sua metionina inicial. Entretanto não foi obtida expressão com esta construção. Para solucionar o problema, foram feitas novas mutações que alteraram os codons AGG presentes nos 25 primeiros codons do gene da proteína por codons CGT, sem alterar o aminoácido codificado. Nesta construção final foi obtida a expressão da proteína sem fusão, que purificada e caracterizada, comporta-se de modo idêntico à troponina I selvagem. / Muscle contraction results from the interaction of myosin with actin and this interaction is controlled by the calcium ion concentration which acts on the regulatory system associated with the actin filaments. This regulatory system comprises one tropomyosin molecule and a complex composed of three polypeptide subunits. One of this subunits, troponin C binds calcium ions; another, troponin T, binds to tropomyosin while the third, troponin I, inhibits the ATPase activity of actomyosin. This dissertation describes the development of the methodology to express troponin I in bacteria and its subsequent purification and characterization. Starting with a troponin I cDNA from chicken skeletal muscle, a pET expression vector was constructed. The initial vector resulted the expression of a troponin I fusion protein having an additional 18 amino acids. This protein was purified and characterized and found to behave like wild type troponin I. Subsequently, employing site-directed mutagenesis, a new vector was made which allowed the expression of the protein starting at its initial methionine codon and lacking the extra amino acids. However, no expression was achieved using this vector and, to circumvent this, further mutations were introduced in the first 25 codons which substituted AGG for CGT without altering the amino acid sequence. This final construct permitted the expression of a non fusion troponin I which, after purification and characterization, was found to behave identically to the wild type protein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-01112012-153354 |
| Date | 21 June 1991 |
| Creators | Ronaldo Bento Quaggio |
| Contributors | Fernando de Castro Reinach, Bianca Silvana Zingales |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Bioquímica), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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