Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T05:05:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2016 / A videira é uma das frutíferas mais produzidas no mundo. Seu cultivo está presente na cultura de praticamente todos os povos e difundida por várias partes do mundo. Contudo, devido à forma de propagação, predominantemente vegetativa, presença constante de fitófagos e utilização de enxertia, é recorrente a presença de vírus fitopatogênicos em plantas de videira. Por este motivo, ao longo dos anos, muitos estudos foram realizados com o objetivo de desenvolver e aperfeiçoar os métodos de indexagem. Os primeiros métodos adotados para indexagem em videiras, foi a observação de sintomas nas plantas ou em plantas indicadoras, através da enxertia, esta pratica é conhecida como indexagem biológica. Com a necessidade de maior agilidade e precocidade para identificação de plantas com vírus, passou-se a ser utilizados métodos de indexagem sorológica, através dos testes do tipo ELISA. ? Neste cenário, o objetivo com este trabalho foi testar e desenvolver métodos confiáveis para a indexagem molecular de videiras, assim como conhecer a presença e distribuição dos principais vírus em viveiros nacionais. Um estudo preliminar foi implantado visando estabelecer um protocolo de extração de RNA adequado para obtenção de material genético com qualidade e pureza. Foram coletadas amostras de 109 plantas matrizes em cinco viveiros nacionais e de um Programa do Banco Genético de Melhoramento da Videira, as amostras foram utilizadas para a realização dos testes sorológico (ELISA) e molecular (RT-qPCR), para os vírus GVA, GVB, GFkV, GFlV, GLRaV-1 e GLRaV-3, o teste ELISA foi realizado utilizando o anti-soro comercial AGRITEST (Valenzano, Itália) e o RT-qPCR através de sonda marcada com química ZenTM (IDT, Coralville, Estados Unidos das Américas). Para o desenvolvimento dos marcadores moleculares, sequências de ORF?s (Open Read Frame) de cada vírus, bem como a sequência do gene 18S rRNA para controle interno, foram obtidas a partir do NCBI e posteriormente análisadas com a ferramenta on line BLAST, para seleção de regiões adequadas para a construção de marcadores moleculares, dentre as sequências obtidas, foi selecionada as regiões com ausência de pontos de mutação após o alinhamento das fitas, para isto, foi utilizado o software BioEdit. Foram construídos marcadores moleculares (forward | probe | reverse) com o quencher interno ZenTM e fluorescência do reporter FAM em três fragmentos genômicos para cada vírus, utilizando o algoritmo da ferramenta on line PrimerQuest. Para os testes de amplificação, via T-qPCR, foi utilizadoIXamostras de três isolados virais distintos e a reação foi realizada com o mastermix QuantiTec Probe (Qiagen, Hilden, Alemanha) em 45 ciclos de amplificação. Nos testes preliminares, foi observado maior qualidade e concentração do RNA obtido extraído a partir de tecidos tenros, como o mesocarpo de frutos e a folha da videira, contudo, devido a estes tecidos possuírem comummente reduzida carga viral, não são utilizados para indexagem, que é tradicionalmente realizada através de segmentos de sarmentos em dormência. Para este tecido, foi observado melhores resultados utilizando o kit de extração RNeasyPlant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). Devido a isto, este kit foi empregado durante o desenvolvimento deste estudo. Os marcadores sintetizados para os vírus GVA, GVB e GFlV não amplificaram na reação de RT-qPCR, provavelmente devido a dificuldade no anelamento das sequências utilizadas, desta forma, para estes vírus será necessário novos estudos para síntese de sequências a serem empregadas na indexagem. Para o GFkV, GLRaV-1 e GLRaV-3 foi possível utilizar os marcadores desenvolvidos neste estudo. Em todos os viveiros coletados foi identificado a presença de ao menos uma planta contaminada por vírus, somente estando livre de contaminação as mudas da coleção do Programa de Melhoramento Genético. O GVB, seguido pelo GFkV foram os vírus encontrados com maior frequência neste estudo, enquanto o GVA foi o único vírus ausente em todas as amostras indexadas. Não foi observado a presença de GLRaV-1 pelo teste ELISA, sendo uma amostra identificada como positiva para este vírus por meio da indexagem molecular. Para os vírus GVA, GVB e GFlV será necessário o desenvolvimento de maiores estudos para validar marcadores moleculares com a química ZenTM (IDT, Coralville, Estados Unidos das Américas), o marcador GLRaV-1 01 e GFkV 01 podem ser empregados para a indexagem para os vírus GLRaV-1 e GFkV respectivamente, bem como os marcadores GFLRaV-3 01 e GLRaV-3 03 podem ser utilizados para indexagem do vírus GLRaV-3 em reações de RT-qPCR a partir de tecidos de videira.<br> / Abstract : The grapevine is one of the fruit world's most productive importance, being rooted in almost all cultures and spread in various parts of the world. However, because the propagation method, predominantly vegetative, through grafting, facilitate the presence of pathogenic viruses in vine tissues. For this reason, over the years, many studies objective develop and improve the indexing methods. The old methods used for vine indexing was the simple observation of symptoms in plants or indicator plants through grafting, this known as a biological indexing. Nowadays, improving the speed and precocity for indexing, serological methods are been adopted, the most common is ELISA test. These due to the strong advance in molecular biology in recent years, which stand out for their accuracy, reliability and speed of execution. However, to adopt molecular tests, it is necessary develop solid and reliable approaches. The objective of this work is test and develop reliable methods for molecular grapevine indexing, as well knowing the presence and distribution of the main virus in National Nurseries. A preliminary study was implanted looking for stablish one adequate RNA extraction protocol to obtain quality genetic material. Were collected samples from 109 plants in 5 national nurseries, and from the Grapevine breeding program and genetic bank, the samples were utilized to make the serological test (ELISA) and molecular (RT-qPCR) to the virus GVA, GVB, GFkV, GFlV, GLRaV-1 and GLRaV-3. The ELISA test made using the commercial anti serological AGRITEST (Valenzano, Italy), and the RT-qPCR through the labeled probe from ZenT chemilcal (IDT, Coralville, USA). To develop molecular markers, ORF?s sequences (Open Read Frame) of each virus, as well the gene sequence of 18S rRNA to internal control, sequences obtained from NCBI and after analyzed with online BLAST tool. To select adequate regions to build molecular markers, between the obtained sequences, the regions with absence of mutation points after alignment were selected, for this; we made use of BioEdit software. Molecular markers (forward/probe/reverse) designed with internal quencher Zen and fluorescence from reporter FAM in three genomic fragments for each virus, utilizing the logarithmic online tool PrimerQuest. For the amplification test, through T-qPCR, we made yse of three distinct viral samples, and the reaction made using mastermix QuantiTec Probe (Qiagen Hilden, Germany) in 45 amplification cycles.XIIn the preliminary tests, more RNA quality and concentration obtained from tender tissues, like fruits mesocarp and grapevine leaf. However, due to the reduced viral charge from this tissue, are not widely used for indexing, normally is used segments from dormancy branches. For this tissue, better results utilizing RNeasyPlant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) observed. For this reason, we made use of this kit during this study. The molecular markers were synthetized to the virus GVA, GVB, and GF1V did not amplify in the RT-qPCR reaction, probably due to annealing difficulties in the utilized sequences, this way, to this virus it is necessary new studies to synthetize sequences for indexing using. To the GFkV, GLRaV-1 and GLRaV-3 the markers developed on this study amplified. In all the nurseries, at least one plant had virus contamination, being free only the collection from the Plant breeding program. The GVB, followed by the GFkV are encountered with more frequency in this study, while the GVA is the only absence in all the samples. The ELISA test did not identify GLRaV-1 to any sample, while one positive sample detected through molecular indexing. To the virus GVA, GVB, and GF1V will be necessary develop more studies to validate molecular markers. The marker GLRaV-1 01 and GFkV 01 are ready to use in indexing of GLRaV-1 e GFkV virus respectively, as well the markers GFLRaV-3 01 e GLRaV-3 03 are to the GLRaV-3 virus in RT-qPCR from grapevine tissues.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsc.br:123456789/168236 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Tomazetti, Tiago Camponogara |
| Contributors | Universidade Federal de Santa Catarina, Silva, Aparecido Lima da, Welter, Leocir José |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 77 p.| il., grafs., tabs. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSC, instname:Universidade Federal de Santa Catarina, instacron:UFSC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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