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Previous issue date: 2006-12-31 / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno emergente, associado à doença diarréica, que apresenta como característica o padrão de adesão agregativo (AA) a superfície de células HEp-2. O fenótipo AA está associado à presença de um plasmídeo de 65 MDa, conhecido como plasmídeo pAA, detectado através de uma sonda genética denominada de CVD432 ou simplesmente AA. Algumas amostras de EAEC, entretanto, apresentam o padrão AA, mas não são portadoras do plasmídeo. No plasmídeo pAA estão presentes vários genes relacionados com as propriedades de virulência, dentre os quais aqueles que codificam as adesinas fimbrias AAF (“Aggregative Adherence Factor” - AAF/I, AAF/II e AAF/III), o regulador de transcrição AggR, a proteína antiagregação (Aap) e as toxinas Pet e EAST1. Outros fatores de virulência de EAEC são codificados por genes cromossômicos, entre eles, a enterotoxina ShET1, o sideróforo Yersiniabactin (irp2), uma ORF críptica (Shf), e uma a-hemolisina. A maioria dos estudos sobre mecanismos de virulência de EAEC compreende amostras que apresentam o padrão AA e que reagem com a sonda AA, ou seja, as amostras de EAEC típicas. Pouco se conhece sobre a presença de potenciais fatores de virulência em amostras de EAEC sonda-negativas, descritas por nós como EAEC atípicas. Neste estudo analisamos 28 amostras de EAEC atípicas isoladas de crianças com diarréia (N = 18) e sem diarréia (N = 10) provenientes de várias cidades brasileiras quanto à presença de seqüências genéticas associadas aos fatores de virulência codificados no plasmídeo pAA e no cromossomo. A maioria das amostras era portadora de dois ou mais genes de virulência, sendo a média dois; porém, duas amostras controles foram negativas para todos os marcadores de virulência pesquisados. Os genes astA, pet, shf, shET/1/pic, irp2 e hly foram encontrados mais freqüentemente em amostras isoladas de casos do que de controles. Quatro amostras apresentaram o gene aggR e em uma delas foi encontrado também as seqüências genéticas aafA e aap. A combinação dos genes astA e shf, foi encontrada em 16 (57%) amostras e 7 (25%) amostras eram portadoras das sequências genéticas astA, shf e irp2.Entre as amostras estudadas, os marcadores genéticos codificados por genes plasmidiais, astA, relacionada a produção de EAST1, e shf associada a uma ORF críptica, foram os mais freqüentes (61%) e apresentaram uma freqüência significantemente maior nos casos do que nos controles estudados (P = 0,003 e P = 0,020, respectivamente). A maioria das amostras de EAEC atípicas estudadas reagiu com um dos 175 antissoros utilizados, sendo que alguns desses, como os sorogrupos O42, O126 e O162 foram os mais freqüentes e encontrados apenas nas amostras isoladas de casos. A análise do perfil plasmidial de 12 amostras isoladas de crianças com diarréia mostrou a presença de mais de um plasmídeo de alto peso molecular na maioria das amostras estudadas. Duas amostras, uma contendo apenas um plasmídeo e uma outra sem nenhum plasmídeo foram então selecionadas para caracterização dos genes envolvidos no padrão AA. A amostra RN691-2 portadora de um único plasmídeo e apresentando resistência antimicrobiana múltipla, foi submetida a experimentos de transformação, conjugação e cura, não sendo possível à obtenção de um transformante, transconjugante ou mesmo a amostra isogênica sem o plasmídeo. Com o objetivo de identificar o(s) gene(s) envolvidos no padrão AA da amostra RN153-1, sem nenhum plasmídeo, foi construída uma biblioteca genômica e identificado um clone-cosmídeo, designado pVIII-F-1, que apresentou o padrão AA em células HEp-2 de maneira semelhante à amostra selvagem. Para localizar o gene necessário para a adesão, o clone cosmídeo foi submetido a mutagênese com o transposon mini-Tn10 (CmR), sendo identificado o mutante pVIII-F-1 / Escherichia coli enteroaggregative (EAEC) is emerging as a significant diarrheal pathogen. EAEC is defined by its characteristic “stacked brick” aggregative adherence (AA) pattern of adherence to HEp-2 cells. Most EAEC strains harbor a 60 to 65-MDa virulence plasmid (pAA). A 1-Kb fragment of pAA, referred to as the AA probe or CVD432, has been widely used for epidemiological studies. The pAA also encodes AA fimbrae (AAF) I, II, and III; the transcriptional activator AggR; enteroaggregative heatstable enterotoxin 1 (EAST1); a 104-KDa cytotoxin designated Pet; the cryptic secreted protein Shf; and a novel antiaggregation protein (dispersin) encoded by the aap gene. In addition to the pAA plasmid, some EAEC strains express putative virulence factors that are encoded on the chromosome, including a 116-KDa secreted mucinase (Pic), yersiniabactin (Irp2), and the E. coli a-hemolysin (a-Hly). Shigella enterotoxin 1 (ShET1) is encoded by the antisense strand of the pic gene. Few studies have evaluated the prevalence of EAEC markers in probe-negative strains, reported by us as atypical EAEC. By using atypical EAEC strains isolated in a case-control study, we assessed the prevalence of putative virulence factors, such as AAF/I, AAF/II, AAF/III, AggR, Aap, EAST-1, Pet, Shf, ShET1/Pic, Irp2, and a-Hly, in an attempt to identify their roles as enteric virulence factors. The majority of strains carried two or more of the genes, with two being the modal value; but two strains isolated from a control did not test positive for any of the factors. The AAF, aggR, and aap genes were present in only a minority of strains. The astA, pet, shf, ShET1/pic, irp2 and hly genes were found more frequently in the patients than in the controls. The combination astA and shf was found in 16 strains (57%), followed by 7 strains (25%) possessing the combination astA, shf, and irp2. The common virulence markers found in strains included the Pet, EAST1, Shf, Irp2, ShET1/Pic, and Hly virulence markers. EAST1 and Shf were the most frequently detected markers (61%) in strains and were found to be significantly associated with diarrhea (P = 0,003 and P = 0,020, respectively). The majority (75%) of the EAEC isolates reacted with one of the antisera used. It was interesting that the strains belonging to serogroups O42, O126 and O162 were detected only in children with diarrhea.Plasmid analysis of 12 strains isolated from diarrhea showed that the majority of strains contained large plasmids. Two strains, one carrying only one plasmid (MA691-2) and another one any plasmid (RN153-1), were chosen for genetic studies on the identification of genes responsible for the AA phenotype. Plasmid from MA691-2 strain was transferred to E. coli K12 and no transformant or transconjugant harboring the plasmid or isogenic derivative strain lacking the plasmid was identified. A genomic cosmid library of EAEC RN153-1 was generated in E. coli K12, and the resulting clones were screened for aggregative adherence to HEp-2 cells. One cosmid clone, pVIII-F-1, exhibited the same adherence as the wild-type, albeit to a lesser extent. Transposon mutagenesis was utilized to identify the region of cosmid pVIII-F-1 responsible for the aggregative phenotype. Plasmid pBSL181 carrying mini-Tn10 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/9598 |
| Date | 31 December 2006 |
| Creators | Zamboni, Andresa [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Scaletsky, Isabel Cristina Affonso [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 140 f. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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