Nesse trabalho enfatizamos o uso de marcadores bioquímicos de estresse oxidativo em microalgas como sinalizadores precoces de exposição a agentes xenobióticos. A curva de crescimento e a taxa de crescimento diário (µ) foram determinadas através do monitoramento in vivo da fluorescência da clorofila. Baseado nos protocolos de testes toxicológicos in vitro, usando microalgas expostas por 48h, determinou-se a concentração efetiva que inibiu 50% de µ (IC50). Culturas de M. polymorphus, com concentração inicial de 1 X 106 células.mL-1, foram submetidas separadamente ao IC50 de oxiflurfeno (OxF) e benzo[a]pireno (BaP) por 48h sendo, posteriormente, coletadas para a análise de cinética enzimática em espectrofotômetro. As análises tanto dos níveis de MDA como dos níveis de GSH/GSSG e Asc- foram feitas em HPLC usando detectores de fluorescência e detectores coulométricos flow-through respectivamente. Além disso, os ensaios sobre a excreção/liberação de H2O2 in vivo foram feitos em um luminômetro usando-se a técnica do luminol. Os valores de IC50 para o OxF e BaP foram de 0,24 µg.L-1 e 0,99 µg.L-1 respectivamente. Os resultados das análises enzimáticas, obtidos nos ensaios com OxF, ao serem comparadas com controles, mostram aumentos para SOD (150 ± 7 e 32 ± 6 USOD.mg.prot-1), seguidos por aumentos menores para CAT (6,5 ± 0,7 e 3,9 ± 0,5 U.mg.prot.-1) e APx (1,01 ± 0,06 e 0,82 ± 0,05 U.mg.prot.-1) respectivamente. Nas culturas expostas ao BaP os resultados, comparados ao controle, mostraram maior atividade de CAT (35,7 ± 1,3 e 4,0 ± 0,9 U.mg.prot.-1) e APx (4,95 ± 0,06 e 0,86 ± 0,03 U.mg.prot.-1) enquanto a SOD foi menos pronunciada (105 ± 6 e 35 ± 5 USOD.mg.prot.-1). As análises das enzimas GR e DHAR quando comparadas ao controle (0,78 ± 0,07 e 0,43 ± 0,08 U.mg.prot.-1 respectivamente) apresentaram-se inibidas em quase 50% quando sob a ação de OxF e não apresentaram variações na presença de BaP. As análises de GST comparadas aos controles, tiveram menor atividade nos grupos sob OxF (176 ± 28 e 73 ± 18 ) frente ao BaP (402 ± 67 e 71 ± 24). Os resultados em HPLC revelaram níveis de MDA elevados nos dois grupos, especificamente 9 e 5 vezes o valor dos controles para as amostras expostas ao OxF e ao BaP respectivamente. Os resultados de GSH mostram diminuição de GSHtotal frente aos controles, em quase 40% sob ação do OxF e mais de 50% nas culturas com BaP. Além disso, a percentagem de GSH na forma de GSSG comparada ao GSHtotal (%IR Índice redox) foi de 60 e 75% nos grupos com OxF e BaP respectivamente. Nos valores obtidos nas análises de Asc- os resultados apontam diminuição em 45% sob OxF e pouco mais de 15% na presença de BaP. As análises de excreção/liberação in vivo de H2O2 mostram acentuada liberação nas células expostas ao OxF quando comparadas ao tratamento com BaP. A observação dos valores de IC50, mostra uma maior toxicidade de OxF quando comparada ao BaP e os resultados das análises das enzimas antioxidantes nos revelam que M. polymorphus usa diferentes estratégias frente aos agentes tóxicos. Tendo em vista a inibição de CAT e APx, as células sob exposição ao OxF utilizam a eliminação direta de H2O2 no meio e, eliminação via ação da GST. No entanto, tal situação parece não diminuir os níveis de lipoperoxidação, mesmo com consumo excessivo de Asc. As culturas expostas ao BaP evitam a evolução de H2O2 via atividade enzimática preferencial e os níveis baixos de GSH denotam a utilização de GST em processos de conjugação de xenobióticos. / The use of biochemical oxidative stress biomarkers in microalgae, as early watches during xenobiotic exposure are emphasized. The growth curve and the diary cells population increase rate (µ) were determined by chlorophyll fluorescence in vivo monitoring. Applying toxicological in vitro tests protocols and using microalgae exposed for 48h, we have determined the effective concentration that provoked 50% of µ inhibition (IC50). M. polymorphus cultures in an initial cellular concentration of 1 X 106 cell.mL-1 were separately submitted to IC50 oxyfluorfen (OxF) and benzo[a]pyrene (BaP) during 48h and, after that, they were gathered to the kinetics enzymatic assay using spectrophotometer. The levels of MDA and the levels of GSH/GSSG plus Asc- were determined in the HPLC system coupling to the fluorescence and coulometric flow-through detectors, respectively. Additionally, in vivo H2O2 excretion/releasing assays were done using a luminometer associated to the luminol technique. The IC50 obtained in the OxF and BaP tests brought out the values 0.24 µ.L-1 and 0.99 µg.L-1 respectively. The results from the enzymatic analyses in the culture under OxF exposure, when compared to the controls, have shown increases in the SOD activities (150 ± 7 and 32 ± 6 USOD.mg.prot-1) followed by minor results to CAT (6.5 ± 0.7 and 3.9 ± 0.5 U.mg.prot.-1) and APx activities (1.01 ± 0.06 and 0.82 ± 0.05 U.mg.prot.-1), respectively. On the other hand, in cultures under BaP treatment, the results compared to the control have shown an increase of CAT (35.7 ± 1.3 and 4.0 ± 0.9 U.mg.prot.-1) and APx activities (4.95 ± 0.06 and 0.86 ± 0.03 U.mg.prot.-1) followed by minor SOD activities (105 ± 6 and 35 ± 5 USOD.mg.prot-1). The results from enzymatic analyses of GR and DHAR under OxF exposure presented around 50% of controls value (0.78 ± 0.07 and 0.43 ± 0.08 U.mg.prot.-1respectively). Contrarily, the culture under BaP treatment didnt show any variation compared to the controls. Instead, GST analyses - in the culture under OxF treatment - have shown minor activity (176 ± 28 and 73 ± 18) facing the cell cultures under BaP exposure (402 ± 67 and 71 ± 24), when compared to the controls. In the cultures under OxF and BaP treatment, HPLC analyses displayed an increase of 9 and 5 fold, respectively, in the MDA levels. The results of GSH in cultures under OxF have shown a decrease of 40% GSHtotal when compared to the control, and more than 50% in cultures under BaP treatment. In addition, the percentage of GSH in the GSSG form compared to GSHtotal (%RI Redox index) was 60 and 75% in the OxF and BaP groups, respectively. In the results obtained in analyses of Asc- there are a decrease of 45% in cultures under OxF and a little bit more than 15% in cultures under BaP treatment. The analyses of in vivo H2O2 excretion/releasing have shown pronounced freeing in the cell under OxF exposure when compared with BaP cultures. The results of IC50 value point to an increased toxicity in cells under OxF treatment in comparison to BaP cultures. On the other hand the results of antioxidant enzymes have shown us different strategies used by M. polymorphus facing the toxic agents. Having in mind the inhibition of CAT and APx, the cells under OxF exposure adopt the direct elimination of H2O2 in the culture medium and via GST activity. However, this situation seems not reduce the lipoperoxidation levels, not even, under the exceedingly Asc- consuming. Cultures exposed to BaP avoid H2O2 evolution de mainly via enzymatic activity and the lower levels of GSH pointing to the activity of GST during xenobiotic conjugation process.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06082009-101115 |
| Date | 17 November 2008 |
| Creators | Torres, Moacir Aluisio |
| Contributors | Colepicolo, Pio |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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